作為微RNA病毒5’非編碼區(qū)（5’UTR）的重要順式作用元件,內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）結(jié)合多種宿主蛋白參與病毒的復(fù)制過(guò)程中。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)口蹄疫病毒（FMDV）IRES結(jié)構(gòu)域4上的C351G突變,能夠?qū)е翭MDV溫度敏感減毒株的產(chǎn)生,然而其溫度敏感性減毒的分子機(jī)制尚不明確。在本研究中,通過(guò)IRES結(jié)構(gòu)分析,我們發(fā)現(xiàn)C351G所在的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)是細(xì)胞多聚嘧啶結(jié)合蛋白（PTB,也稱為hnRNP1）與IRES相互作用的區(qū)域之一,而PTB是IRES介導(dǎo)的翻譯起始過(guò)程中的關(guān)鍵宿主因子。因此,我們推測(cè)C351G突變可能改變了 IRES與PTB蛋白的結(jié)合,從而決定FMDV的溫度敏感減毒表型。通過(guò)RNA pulldown和親和力試驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)C351G突變引起PTB與FMDV IRES結(jié)合發(fā)生溫度依賴性減弱,進(jìn)而引起IRES溫度依賴性翻譯缺陷,是導(dǎo)致FMDV溫度敏感性減毒的分子基礎(chǔ)。PTB蛋白,也稱為核不均一核糖核蛋白Ⅰ（hnRNPⅠ）,是核不均一核糖核蛋白家族（hnRNPs）的重要成員。然而,除了 PTB蛋白,還有哪些關(guān)鍵宿主蛋白參與并調(diào)控FMDV的復(fù)制,信息有限。因此,為了篩選與FMDV... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁(yè)數(shù)】：69 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

圖１．１?口蹄疫病毒基因組結(jié)構(gòu)（引自Ｍａｓｏｉｉ?ｅｔａ丨．２００３）??Ｆｉｇ?１．１?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆｔｌｉｅ?ＦＭＤＶ?ｇｅｎｏｍｅ?（Ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ?ｆｒｏｍ?Ｍａｓｏｎ?ｅｔ?ａｌ．?２００３）??

ｍ??ＨＩＶ?逆轉(zhuǎn)錄病臠?激活雎轉(zhuǎn)錄倌號(hào)．促進(jìn)病隳轉(zhuǎn)錄??ＨＢＶ?丨）ＮＡ病賽?調(diào)控病和復(fù)制??ＶＳＶ?負(fù)鏈ＲＮＡ病濤?抑制宿主細(xì)胞凋亡，促逬病供詡白質(zhì)衷達(dá)??ＥＶ７１?撖小卜?結(jié)合癍遘丨《ＮＡ５１非編碼區(qū)．參與病＊復(fù)制??ｈｎＲＮＰ?１．?ＨＣＶ?正鏈ＲＮＡ病毒?埔強(qiáng)病毒翮譯效率??ＨＤＶ?負(fù)鏈ＲＮＡ病毒?結(jié)合病霉ＲＮＡ??ＨＳＶ?ＤＮＡ�。�?促進(jìn)病霉ｎｉＲＮＡ稞定性和核戍遷移??ｈｎＲＮＰ?Ｕ?ＨＩＶ?逆轉(zhuǎn)錄病輯?調(diào)控�。眨恚遥危练�(wěn)定性??圖１．５ｈｎＲＮＰｓ對(duì)病毒復(fù)制的影響（引自馮曉輝ｅｔａｌ．２０１５）??Ｆｉｇ?１．５?Ｉ＇ｆＴｅｃｔ?ｏｆｈｎＲＮＰｓ?ｏｎ?ｖｉｍｓ?ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ?（Ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ?ｆｒｏｍ?Ｘｉａｏｈｕｉ?Ｆｅｎｇ?ｅｔ?ａｌ．?２０１５）．??１．４．２核不均一核糖核蛋白Ｉ的結(jié)構(gòu)與功能??核＞ｆ、均■核糖核蛋白?Ｋｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ?ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ?Ｉ，ｈｎＲＮＰ?Ｌ），??也稱為多聚嘧啶結(jié)合蛋白（ＰＴＢ或ＰＴＢＰ１），是ｈｎＲＮＰｓ家族中研究最廣??泛的剪接調(diào)控因子之一（Ｂｕｓｈｅｌｌ?ｅｔ?ａｌ．，２００６）。ＰＴＢ相對(duì)分子質(zhì)量為５７??０００，是一種大多數(shù)組織廣泛表達(dá)的ＲＮＡ結(jié)合蛋白，是一種核質(zhì)累積的??核質(zhì)穿梭蛋白。它包含四個(gè)ＲＮＡ識(shí)別模序（ＲＮＡ?ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ?ｍｏｔｉｆｓ，??ＲＲＭ）包括?ＲＢＤ１，ＲＢＤ２，ＲＢＤ３，ＲＢＤ４?（Ｍａｒｉｓ?ｅｔａｌ＿，２００５），常與?ＲＮＡ??序列中的嘧啶富集區(qū)域結(jié)合，ＰＴＢ參與ｍＲＮＡ代謝的多個(gè)方面能夠影??響ｍＲＮＡ的定位，ＩＲＥＳ介導(dǎo)翻譯起始，

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后出站報(bào)告?研宄報(bào)告??Ｉ）與ＩＲＥＳ相互作用的區(qū)域之一，而ＰＴＢ是ＩＲＥＳ介導(dǎo)的翻譯起始過(guò)程??中的關(guān)鍵宿主因子。因此，我們推測(cè)Ｃ３５１Ｇ突變可能改變了?ＩＲＥＳ與ＰＴＢ??蛋白的結(jié)合，從而決定ＦＭＤＶ的溫度敏感減毒表型。通過(guò)ＲＮＡ?ｐｕｌｌｄｏｗｎ??試驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)與野生型ＩＲＥＳ相比，Ｃ３５１Ｇ突變破壞了?ＩＲＥＳ與ＰＴＢ的??結(jié)合。重要的是，當(dāng)溫度從３７°Ｃ升高到４１°Ｃ時(shí)，ＰＴＢ與ＩＲＥＳ的結(jié)合越??來(lái)越受到抑制（圖２．１Ａ）。為了更準(zhǔn)確測(cè)定Ｃ３５１Ｇ突變對(duì)ＩＲＥＳ－ＰＴＢ相??互作用的影響，我們利用生物層干涉法，定量測(cè)定了平衡離解常數(shù)（ＩＣＤ）。??結(jié)果表明，與野生型ＩＲＥＳ相比，具有Ｃ３５１Ｇ突變的ＩＲＥＳ與ＰＴＢ的結(jié)??合親和力隨著溫度的升高而降低，在３３°Ｃ時(shí)Ｃ３５１Ｇ突變的ＩＲＥＳ與ＰＴＢ??的結(jié)合親和力比野生型ＩＲＥＳ下降１．２２倍，在３７°Ｃ時(shí)下降１．３７倍，在??４１°Ｃ時(shí)下降４．６２倍（圖２．１Ｂ），進(jìn)一步支持了?Ｃ３５１Ｇ突變以溫度依賴的??方式損害了?ＦＭＤＶ－ＩＲＥＳ與細(xì)胞ＰＴＢ的相互作用。??Ａ?Ｂ??Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ?Ｋ〇?（Ｍ）?Ｋｏｎ?（１／Ｍｓ）?Ｋ＾ｉ．?（１／ｓ）??＾??［＾ＥＳ??—３３＊Ｃ?３?１ＢＥ－０８?６?２７Ｅ＋０４?１?９９Ｅ－０３??ｃ?３３－Ｃ?３７＊Ｃ?４１＊Ｃ?３３＊Ｃ?３７－Ｃ?４１＊Ｃ?ＩＲＥＳ／ＰＴＢ?３７Ｘ?５?８４Ｅ－０８?４?８９Ｅ＋０４?２?８５Ｅ－０３??——ｍｍｍｍ?曬－?ＰＴＢ?４１＊Ｃ?１?４１Ｅ－０７?４?１４Ｅ＋０４?５．８３Ｅ－０３??３３＊Ｃ?３．８８Ｅ－０８?５．７７

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]核不均一核糖核蛋白與病毒復(fù)制[J]. 馮曉輝,湯承,朱鑫,岳華.  畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2015(06)
[2]O型泛亞譜系口蹄疫病毒cDNA感染性克隆的建立[J]. 楊德成,涂亞斌,王海偉,周國(guó)輝,于力.  中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2009(01)

博士論文
[1]可變剪切因子hnRNPL及組蛋白伴侶FACT復(fù)合物亞基SSRP1的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究[D]. 張文娟.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué) 2013



本文編號(hào)：3421125