本文關(guān)鍵詞：新城疫病毒V蛋白結(jié)合MDA5抑制DF-1細(xì)胞IFN-β生成的功能域研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：新城疫(Newcastle diseases,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一種嚴(yán)重危害多種禽類健康的病毒性傳染病。NDV屬于副黏病毒科(Paramyxovirudae)、禽副黏病毒屬(Avulavirus)。病毒基因組為單股負(fù)鏈RNA,長(zhǎng)度約為15 kb。隨著NDV感染和致病宿主范圍不斷的擴(kuò)大,ND的防控面臨新挑戰(zhàn)。干擾素系統(tǒng)在宿主抵抗病毒中發(fā)揮著舉足輕重的作用,是宿主防御病毒的重要防線。研究發(fā)現(xiàn),副黏病毒編碼的的V蛋白能夠通過拮抗宿主干擾素系統(tǒng),逃逸宿主免疫系統(tǒng)的清除。近年來研究發(fā)現(xiàn),NDV能夠通過其P基因的RNA編輯作用產(chǎn)生V蛋白,編碼產(chǎn)生的V蛋白能夠抵御宿主干擾素系統(tǒng)。NDV V蛋白發(fā)揮拮抗干擾素的功能不僅體現(xiàn)在能夠阻斷干擾素JAK/STAT信號(hào)通路,還可以直接與模式識(shí)別受體MDA5結(jié)合,抑制IFN-β的產(chǎn)生�，F(xiàn)有的研究表明,V蛋白與MDA5的結(jié)合區(qū)位于其C端的半胱氨酸富集區(qū),但是具體是哪些氨基酸殘基發(fā)揮關(guān)鍵作用,其他殘基的作用如何,目前尚不清楚。此外,有研究推測(cè)V蛋白N端的一些殘基在拮抗干擾素中也發(fā)揮一定作用。為了闡明NDV V蛋白結(jié)合MDA5抑制IFN-β生成的功能域,本研究在系統(tǒng)分析NDV與其他副黏病毒V蛋白CTD(C-terminal domain,CTD)區(qū)序列和N端可能存在功能域的基礎(chǔ)上,突變單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基,從IFN-β啟動(dòng)子、m RNA和蛋白水平以及與MDA5相互作用方面研究突變體對(duì)拮抗IFN-β的影響,對(duì)V蛋白干擾MDA5互作拮抗IFN-β產(chǎn)生的功能域做了詳細(xì)的研究。研究分為以下幾個(gè)部分:1、CTD區(qū)鋅指結(jié)構(gòu)氨基酸對(duì)新城疫病毒V蛋白與MDA5相互作用的影響為了探討NDV V蛋白C端鋅指結(jié)構(gòu)的組氨酸和7個(gè)半胱氨酸殘基在MDA5互作中的作用。參考副流感病毒5型(Parainfluenza virus type 5,PIV5)V蛋白C端的研究結(jié)果,模擬NDV V蛋白的鋅指結(jié)構(gòu),并對(duì)鋅指結(jié)構(gòu)的組氨酸和7個(gè)半胱氨酸殘基進(jìn)行突變,在啟動(dòng)子、m RNA和蛋白水平檢測(cè)V蛋白突變體過表達(dá)對(duì)DF-1細(xì)胞IFN-β的影響。結(jié)果顯示,8個(gè)V蛋白突變體均構(gòu)建成功并在DF-1細(xì)胞獲得高效表達(dá),且表達(dá)量與野生型一致;NDV的野生型V蛋白具有抑制poly(I:C)誘導(dǎo)的DF-1細(xì)胞IFN-β啟動(dòng)子活性,進(jìn)而影響IFN-β的轉(zhuǎn)錄和翻譯。V蛋白C端大鋅指結(jié)構(gòu)區(qū)域的H177、C196、C221和C224殘基是V蛋白結(jié)合MDA5抑制DF-1細(xì)胞IFN-β非必需殘基,而小鋅指結(jié)構(gòu)區(qū)域的C200、C212、C214和C217是必需殘基。2、CTD區(qū)其他保守氨基酸對(duì)新城疫病毒V蛋白與MDA5相互作用的影響為了弄清NDV V蛋白CTD區(qū)除了形成鋅指結(jié)構(gòu)的8個(gè)氨基酸殘基外其余保守氨基酸殘基在結(jié)合MDA5抑制IFN-β產(chǎn)生的作用,選取15個(gè)保守氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變和MDA5共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞,檢測(cè)DF-1細(xì)胞IFN-β啟動(dòng)子水平、m RNA水平和蛋白水平的差異情況,確定影響V蛋白與MDA5相互作用的關(guān)鍵性殘基。結(jié)果表明,V蛋白的15個(gè)突變體在DF-1細(xì)胞中的表達(dá)量與野生型一致,R178和I183對(duì)于V蛋白抑制DF-1細(xì)胞IFN-β是必需的關(guān)鍵殘基,精氨酸和異亮氨酸突變體不能與MDA5結(jié)合而失去拮抗宿主IFN-β的能力;E180對(duì)V蛋白起支持作用,而剩余的12個(gè)氨基酸殘基是V蛋白結(jié)合MDA5非必需的,它們的點(diǎn)突變不影響V蛋白與MDA5的相互作用。并且178位的精氨酸R變?yōu)橘嚢彼酜時(shí)依然能夠與MDA5結(jié)合,180位的谷氨酸E變?yōu)樘於彼酓后也保持與MDA5的結(jié)合能力,說明178位、180位和183位分別是堿性氨基酸、酸性氨基酸和異亮氨酸是V蛋白結(jié)合MDA5必需的。3、新城疫病毒V蛋白N端氨基酸對(duì)V蛋白與MDA5相互作用的影響對(duì)NDV V蛋白N端某些氨基酸殘基在V蛋白與MDA5結(jié)合中的作用進(jìn)行研究,選擇NDV V蛋白N端的7個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行定點(diǎn)突變,應(yīng)用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)、real time PCR和ELSA的方法檢測(cè)突變體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的干擾素水平,免疫共沉淀驗(yàn)證突變體與MDA5的相互作用情況。結(jié)果表明,V蛋白N端65位(N)殘基對(duì)于V蛋白與MDA5的互作有輕微影響,突變之后DF-1細(xì)胞IFN-β水平有所升高,但并不明顯,啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄和蛋白水平上結(jié)果一致,但在共沉淀試驗(yàn)中卻不能體現(xiàn),提示NDV V蛋白的N端氨基酸殘基對(duì)V蛋白拮抗宿主細(xì)胞IFN-β產(chǎn)生有輕微影響。綜上所述,本研究較為詳細(xì)的闡明了NDV V蛋白結(jié)合MDA5抑制宿主細(xì)胞IFN-β產(chǎn)生的主要功能域,研究表明V蛋白不同的氨基酸殘基在結(jié)合MDA5抑制宿主細(xì)胞IFN-β產(chǎn)生方面發(fā)揮著不同的作用。本研究可為更深一步探究NDV V蛋白拮抗干擾素機(jī)理奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：新城疫病毒 V蛋白 黑色素瘤相關(guān)因子5 β干擾素 功能域
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 摘要6-8
• abstract8-14
• 文獻(xiàn)綜述14-24
• 第一章 副黏病毒V蛋白拮抗干擾素的研究進(jìn)展14-24
• 1.1 新城疫的概述14-15
• 1.2 新城疫病毒15-17
• 1.2.1 NDV的結(jié)構(gòu)15
• 1.2.2 NDV的分型15-16
• 1.2.3 NDV的基因組16-17
• 1.3 副黏病毒拮抗干擾素的研究進(jìn)展17-23
• 1.3.1 副黏病毒的P基因17-19
• 1.3.2 Ⅰ型IFN系統(tǒng)19-20
• 1.3.3 副黏病毒拮抗IFN的細(xì)胞目標(biāo)20-22
• 1.3.4 副黏病毒阻斷干擾素Jak/STAT信號(hào)通路22-23
• 1.4 本研究的目的意義23-24
• 試驗(yàn)研究24-64
• 第二章CTD區(qū)鋅指結(jié)構(gòu)氨基酸對(duì)NDV V蛋白與MDA5 互作抑制IFN-β 生成的影響 1124-39
• 2.1 材料24
• 2.1.1 質(zhì)粒24
• 2.1.2 細(xì)胞24
• 2.2 方法24-30
• 2.2.1 副黏病毒V蛋白CTD區(qū)的序列分析24
• 2.2.2 點(diǎn)突變引物設(shè)計(jì)24-25
• 2.2.3 重組質(zhì)粒pCMV-3HA- H/C1~C7 的構(gòu)建25-26
• 2.2.4 ChMDA5 真核表達(dá)載體的構(gòu)建26
• 2.2.5 Western blotting檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)26-27
• 2.2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)IFN-β 啟動(dòng)子活性27-28
• 2.2.7 Real time PCR測(cè)定IFN-β mRNA水平28
• 2.2.8 ELISA測(cè)定IFN-β 蛋白水平28
• 2.2.9 免疫共沉淀試驗(yàn)驗(yàn)證V蛋白突變體與MDA5 的相互作用28-29
• 2.2.10 多個(gè)氨基酸突變的影響29-30
• 2.3 結(jié)果30-37
• 2.3.1 副黏病毒V蛋白CTD區(qū)的序列比對(duì)結(jié)果30-31
• 2.3.2 重組質(zhì)粒pCMV-3HA-H/C1~C7 的構(gòu)建31-32
• 2.3.3 ChMDA5 真核表達(dá)載體的構(gòu)建32-33
• 2.3.4 V蛋白及突變體表達(dá)的檢測(cè)33
• 2.3.5 IFN-β 啟動(dòng)子活性檢測(cè)33-34
• 2.3.6 IFN-β mRNA檢測(cè)34-35
• 2.3.7 IFN-β 蛋白檢測(cè)35-36
• 2.3.8 V蛋白及V蛋白突變體與MDA5 相互作用檢測(cè)36
• 2.3.9 多個(gè)氨基酸突變對(duì)V蛋白功能的影響36-37
• 2.4 討論37-38
• 2.5 小結(jié)38-39
• 第三章CTD區(qū)其他保守氨基酸對(duì)NDV V蛋白與MDA5 互作抑制IFN-β生成的影響39-53
• 3.1 材料39
• 3.1.1 質(zhì)粒39
• 3.1.2 細(xì)胞39
• 3.2 方法39-44
• 3.2.1 副黏病毒V蛋白CTD區(qū)的序列分析39
• 3.2.2 點(diǎn)突變引物設(shè)計(jì)39-41
• 3.2.3 重組質(zhì)粒pCMV-3HA-△V的構(gòu)建41
• 3.2.4 Western blotting檢測(cè)V蛋白突變體表達(dá)41
• 3.2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)IFN-β 啟動(dòng)子活性41-42
• 3.2.6 real time PCR測(cè)定IFN-β mRNA水平42
• 3.2.7 ELISA測(cè)定IFN-β 蛋白水平42
• 3.2.8 免疫共沉淀試驗(yàn)驗(yàn)證V蛋白突變體與MDA5 的相互作用42-44
• 3.2.9 幾個(gè)重要氨基酸的確定44
• 3.3 結(jié)果44-50
• 3.3.1 重組質(zhì)粒pCMV-3HA-△V的構(gòu)建44-45
• 3.3.2 V蛋白突變體表達(dá)的檢測(cè)45-46
• 3.3.3 IFN-β 啟動(dòng)子活性檢測(cè)46-47
• 3.3.4 IFN-β mRNA檢測(cè)47
• 3.3.5 IFN-β 蛋白檢測(cè)47-48
• 3.3.6 V蛋白及V蛋白突變體與MDA5 相互作用檢測(cè)48-49
• 3.3.7 R178 和E180 對(duì)V蛋白的影響49-50
• 3.4 討論50-52
• 3.5 小結(jié)52-53
• 第四章 新城疫病毒V蛋白N端氨基酸對(duì)V蛋白與MDA5 相互作用抑制IFN-β生成的影響53-64
• 4.1 材料53
• 4.1.1 質(zhì)粒53
• 4.1.2 細(xì)胞53
• 4.2 方法53-58
• 4.2.1 不同NDV V蛋白的序列分析53-54
• 4.2.2 點(diǎn)突變引物設(shè)計(jì)54
• 4.2.3 重組質(zhì)粒pCMV-3HA-△V的構(gòu)建54-55
• 4.2.4 Western blotting檢測(cè)V蛋白突變體的表達(dá)55-56
• 4.2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)IFN-β 啟動(dòng)子活性56
• 4.2.6 real time PCR測(cè)定IFN-β mRNA水平56
• 4.2.7 ELISA測(cè)定IFN-β 蛋白水平56-57
• 4.2.8 免疫共沉淀試驗(yàn)驗(yàn)證V蛋白突變體與MDA5 的相互作用57-58
• 4.3 結(jié)果58-62
• 4.3.1 重組質(zhì)粒pCMV-3HA-△V的構(gòu)建58-59
• 4.3.2 V蛋白突變體表達(dá)的檢測(cè)59-60
• 4.3.3 IFN-β 啟動(dòng)子活性檢測(cè)60
• 4.3.4 IFN-β mRNA檢測(cè)60-61
• 4.3.5 IFN-β 蛋白檢測(cè)61-62
• 4.3.6 V蛋白N端突變體與MDA5 相互作用檢測(cè)62
• 4.4 討論62-63
• 4.5 小結(jié)63-64
• 結(jié)論64-65
• 本論文的創(chuàng)新點(diǎn)65-66
• 參考文獻(xiàn)66-77
• 附錄77-81
• 縮略詞表81-83
• 致謝83-84
• 作者簡(jiǎn)介84-85

【參考文獻(xiàn)】

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 陳勝利;不同宿主來源新城疫病毒全基因組特征及其V蛋白對(duì)DF-1細(xì)胞IFN-β生成的影響[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2013年

  本文關(guān)鍵詞：新城疫病毒V蛋白結(jié)合MDA5抑制DF-1細(xì)胞IFN-β生成的功能域研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：330983