本文關(guān)鍵詞：刺槐中參與共生固氮的結(jié)瘤相關(guān)基因的分離鑒定和功能分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：根瘤的產(chǎn)生是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程,包括根瘤菌侵染植物根部細(xì)胞,植物根部細(xì)胞分化,根瘤的成熟和固氮。在結(jié)瘤過程中,宿主植物根部細(xì)胞大量基因差異表達(dá),構(gòu)成復(fù)雜的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。結(jié)瘤素基因是在結(jié)瘤過程中特異表達(dá)或表達(dá)增強(qiáng)的豆科植物基因。目前,豆科模式植物蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)和日本百脈根(Lotus japonicus)中的許多結(jié)瘤素基因已經(jīng)被分離鑒定,但是對于豆科樹種,如刺槐,關(guān)于其結(jié)瘤機(jī)理的研究尚未開展,刺槐結(jié)瘤素基因尚未被報(bào)道。因此,從轉(zhuǎn)錄組水平上全面系統(tǒng)了解刺槐在結(jié)瘤過程中的基因差異表達(dá)譜,分離鑒定結(jié)瘤素基因,是研究刺槐結(jié)瘤機(jī)制的有效手段,對分離鑒定出的結(jié)瘤素基因,利用反向遺傳學(xué)方法—RNA干擾誘導(dǎo)的基因沉默來分析結(jié)瘤素基因的功能,為闡明刺槐結(jié)瘤分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。本文以刺槐(Robinia pseudoacacia)與中慢生根瘤菌(Mesorhizobium amorphae CCNWGS0123)建立的共生結(jié)瘤體系為研究對象,使用抑制差減雜交技術(shù)對刺槐結(jié)瘤過程中其根部基因的差異表達(dá)進(jìn)行分析,構(gòu)建正、反交2個(gè)差減c DNA文庫,克隆差異表達(dá)基因;利用q RT-PCR驗(yàn)證結(jié)瘤相關(guān)基因在根瘤發(fā)育不同階段的表達(dá)趨勢;使用RACE方法,克隆目的基因全長,運(yùn)用生物信息學(xué)分析候選基因的基本特征;使用RNAi技術(shù)對候選基因進(jìn)行初步的功能分析。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:1.為更清楚觀察M.amorphae CCNWGS0123的侵染過程,使用綠色熒光蛋白標(biāo)記該菌株,把Plac Z egfp質(zhì)粒p MP2444通過電穿孔轉(zhuǎn)入M.amorphae CCNWGS0123中,標(biāo)記后的菌命名為G186,在紫外光下能發(fā)出綠色熒光。使用熒光顯微鏡觀察記錄G186入侵刺槐根部的過程,根據(jù)觀察結(jié)果,驗(yàn)證了刺槐根瘤菌通過侵入線進(jìn)入刺槐根皮層細(xì)胞,與其他豆科牧草植物相比其整個(gè)結(jié)瘤周期較長。我們把刺槐結(jié)瘤過程分為三個(gè)階段:早期階段,接菌后0-7d,出現(xiàn)根毛變形,大量根瘤菌被包裹到變形的根毛中;中期階段,接菌后7-18d,侵入線及根瘤原基已經(jīng)形成,位于侵入線中的根瘤菌開始釋放到根瘤原基中;晚期階段,接菌后18d及以后,根瘤成熟,開始行使固氮功能。2.分別對苗齡1、4、6、8、11、14、18和22 d的刺槐接菌根和不接菌的對照根取樣,抽提樣品總RNA并從中分離純化出m RNA,利用抑制差減雜交技術(shù)分離兩個(gè)樣品間差異表達(dá)基因,構(gòu)建了正、反交兩個(gè)差減c DNA文庫,每個(gè)文庫包含大約600個(gè)克隆子。其中正交文庫(Forward SSH library,FSL)篩選得到的是相對于不接菌根,在接菌根中特異性表達(dá)或者表達(dá)量增加的基因;反交文庫(Reverse SSH library,RSL)篩選得到的是相對于接菌根,在不接菌根中特異性表達(dá)或表達(dá)量增加的基因。為去除抑制差減雜交過程中產(chǎn)生的假陽性片段,利用反向斑點(diǎn)雜交(RDB)對差減文庫中的克隆子進(jìn)行第一次篩選,以371個(gè)正交克隆子和247個(gè)反交克隆子點(diǎn)膜,雜交后選取正向探針雜交信號高于反向探針5倍的樣點(diǎn),送樣測序。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果為研究刺槐結(jié)瘤素基因奠定分子基礎(chǔ)。3.根據(jù)反向斑點(diǎn)雜交篩選結(jié)果,從兩個(gè)文庫中共選取251個(gè)正、反交克隆子進(jìn)行測序。去除測序結(jié)果差的,共得到212個(gè)序列,使用TIGR assembler裝配成135 singletons和27 contigs,最終得到162 unigenes(正交序列114條/反交序列48條),序列片段在200 bp到900 bp之間。這些序列被提交到NCBI db EST數(shù)據(jù)庫中,分配的Genbank accession numbers是JK974084-JK974245。162 unigenes在NCBI非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLASTX序列比對,根據(jù)注釋結(jié)果把162個(gè)ESTs人工歸類為14個(gè)功能類群。在14個(gè)功能類群中,其中占比例最大的是未知功能類群(23%),大量未知基因的篩選證明了目前刺槐基因組信息的缺乏。由于本實(shí)驗(yàn)的重點(diǎn)是尋找結(jié)瘤過程中表達(dá)增強(qiáng)的基因,所以我們把正交文庫中的基因作為研究的重點(diǎn),根據(jù)BLASTX功能注釋和GO(Gene Ontology)功能分類,正交文庫的114 unigenes重新分為13個(gè)類群。根據(jù)BLASTX結(jié)果,80 unigenes(70%)編碼的蛋白能在NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫中找到相似序列。在這些注釋的基因中,占比例較大類群的是參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控(10.5%)、蛋白質(zhì)的代謝與合成(14.0%)、防御(10.5%)及信號傳遞(7.9%)相關(guān)的基因。因此我們推測,在刺槐共生結(jié)瘤固氮過程中,發(fā)生了不同水平的分子調(diào)控,包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、翻譯調(diào)控及翻譯后調(diào)控。調(diào)控類基因通常在結(jié)瘤過程中行使重要作用,因此我們從正交文庫中挑選可能與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白質(zhì)的合成與代謝、信號傳導(dǎo)相關(guān)的調(diào)控類基因28條,通過RT-PCR分析,其中21個(gè)基因在接菌根中表達(dá)上調(diào),包括9個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控類基因、8個(gè)翻譯后修飾基因及4個(gè)膜蛋白基因。使用q RT-PCR對這些上調(diào)基因進(jìn)行進(jìn)一步表達(dá)譜分析。最后使用RACE方法獲取目的基因的全長,并對部分基因用Clustal W進(jìn)行多重序列比對找到蛋白質(zhì)保守區(qū)域。4.通過q RT-PCR的方法從抑制差減雜交正交文庫中篩選到5個(gè)晚期結(jié)瘤素基因,分別是:2zheng43、2zheng44、2zheng45、2zheng190和2zheng287,五個(gè)基因在刺槐結(jié)瘤過程中的時(shí)空表達(dá)特征分析表明,這些基因在晚期結(jié)瘤根(18 dai,24dai)和根瘤(N30)中特異誘導(dǎo)表達(dá),而在早期結(jié)瘤根(0、7、10、14 dai)、去瘤根(Root 30)、不結(jié)瘤對照根(CK30)及結(jié)瘤植株的莖(Stem)、葉(Leaf)中不被誘導(dǎo)表達(dá)(2zheng43除外),因此這些基因是典型的晚期結(jié)瘤素基因,并且除2zheng43外,其他4個(gè)基因是特異表達(dá)的晚期結(jié)瘤素基因,這些基因可能與刺槐根瘤形成或維持根瘤功能相關(guān)。利用RACE方法獲得5個(gè)基因的全長:2zheng43(1455 bp)、2zheng44(608 bp)、2zheng45(656 bp)、2zheng190(580 bp)和2zheng287(689 bp),分別編碼412、152、106、86和113個(gè)氨基酸,編碼的蛋白分別是:糖基水解酶超家族蛋白(2zheng43)、豆血紅蛋白(2zheng44)、鋅指結(jié)構(gòu)超家族(2zheng190)、假定膜蛋白(2zheng45),2zheng287在BLASTX比對中無相似序列,只在BLASTN比對中與山羊豆(Galega orientalis)的根瘤特異表達(dá)m RNA有較高相似性。Inter Pro Scan預(yù)測2zheng45編碼蛋白的前43個(gè)氨基酸和2zheng43蛋白的前28個(gè)氨基酸序列是典型的信號肽結(jié)構(gòu),并且2zheng45編碼蛋白含有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)。5.建立了發(fā)根農(nóng)桿菌K599誘導(dǎo)的刺槐毛狀根轉(zhuǎn)化體系,利用RNAi研究了2zheng43、2zheng45、2zheng190和2zheng287(2zheng44編碼的豆血紅蛋白功能已知)在根瘤發(fā)育過程中的功能。為驗(yàn)證目的片段沉默效果,使用q RT-PCR檢測干擾基因在接菌后20d、30d和40d的RNAi根瘤和對照根瘤中的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示,在相應(yīng)的RNAi干擾根瘤中2zheng43和2zheng45基因被有效沉默。統(tǒng)計(jì)接種后10d、20d、30d和40d的2zheng43和2zheng45RNAi植株的結(jié)瘤情況,發(fā)現(xiàn)與對照植株相比,RNAi植株結(jié)瘤數(shù)目偏少,根瘤個(gè)頭小,并且白色無效瘤比例高。用q RT-PCR檢測接種后20d、30d和40d的干擾植株與對照植株的根瘤中豆血紅蛋白基因的轉(zhuǎn)錄活性,結(jié)果表明:與對照株根瘤相比,2zheng43和2zheng45RNAi根瘤中豆血紅蛋白基因表達(dá)量明顯下降。根據(jù)根瘤石蠟切片顯示的根瘤內(nèi)部特征,接種后20d和40d的對照株根瘤表現(xiàn)出較好的狀態(tài),根瘤中含菌細(xì)胞密實(shí)規(guī)律排布,形狀規(guī)則,然而在RNAi根瘤中,含菌細(xì)胞分布松散沒有規(guī)律,形狀不規(guī)則,有些侵染線中的根瘤菌沒有釋放到根瘤細(xì)胞中。特別是40dai的2zheng43RNAi根瘤中含菌細(xì)胞數(shù)目少,并且形狀不規(guī)則,有衰老跡象。由以上結(jié)果可知,2zheng43和2zheng45基因表達(dá)抑制后,其植株表現(xiàn)為延緩了根瘤發(fā)育、根瘤固氮能力下降,說明這些基因及其編碼蛋白在根瘤發(fā)育和固氮方面發(fā)揮著重要作用。
【關(guān)鍵詞】：刺槐 抑制差減雜交 結(jié)瘤素基因 表達(dá)譜 RNA干擾 功能驗(yàn)證
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q943.2
【目錄】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-15
• 第一章 文獻(xiàn)綜述15-33
• 1.1 生物固氮15
• 1.2 豆科植物與根瘤菌共生固氮15-23
• 1.2.1 豆科植物根瘤的形成過程16-17
• 1.2.2 根瘤的類型-定型瘤和不定型瘤17-18
• 1.2.3 豆科植物結(jié)瘤分子機(jī)制18-23
• 1.3 轉(zhuǎn)錄水平上的差異表達(dá)基因分離方法23-27
• 1.3.1 cDNA-AFLP技術(shù)23-24
• 1.3.2 cDNA微陣列和DNA微陣列24
• 1.3.3 轉(zhuǎn)錄組測序24
• 1.3.4 抑制差減雜交（Suppressive Subtractive Hybridization, SSH24-27
• 1.4 RNA干擾27-30
• 1.4.1 RNAi的發(fā)現(xiàn)及機(jī)理27-29
• 1.4.2 RNAi在植物基因功能研究中應(yīng)用29-30
• 1.4.3 豆科植物RNAi的研究現(xiàn)狀30
• 1.5 本研究的目的意義及技術(shù)路線30-33
• 1.5.1 目的意義30-31
• 1.5.2 技術(shù)路線31-33
• 第二章 中慢生根瘤菌的eGFP標(biāo)記及其侵染觀察33-41
• 2.1 引言33
• 2.2 材料、試劑和儀器33-34
• 2.2.1 材料33
• 2.2.2 試劑33
• 2.2.3 儀器33-34
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法34-37
• 2.3.1 pMP2444 質(zhì)粒的提取與檢測34
• 2.3.2 M.amorphae CCNWGS0123 感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化34-35
• 2.3.3 轉(zhuǎn)化子的檢測35-36
• 2.3.4 刺槐的種植與根瘤菌的侵染觀察36-37
• 2.4 結(jié)果與分析37-40
• 2.4.1 質(zhì)粒提取結(jié)果分析37
• 2.4.2 轉(zhuǎn)化子的檢測37-38
• 2.4.3 eGFP基因的擴(kuò)增與檢測38
• 2.4.4 侵染過程觀察與分析38-40
• 2.5 討論40-41
• 第三章 刺槐結(jié)瘤相關(guān)基因SSH文庫的構(gòu)建及質(zhì)量檢測41-56
• 3.1 引言41
• 3.2 材料、試劑和儀器41-42
• 3.2.1 材料41
• 3.2.2 試劑41-42
• 3.2.3 儀器42
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法42-51
• 3.3.1 植物材料與根瘤菌培養(yǎng)42
• 3.3.2 RNA提取及去除基因組DNA42-43
• 3.3.3 植物基因組DNA提取43
• 3.3.4 mRNA分離純化43-44
• 3.3.5 抑制差減雜交44-49
• 3.3.6 差減cDNA文庫的構(gòu)建49-50
• 3.3.7 差示篩選50-51
• 3.4 結(jié)果與分析51-55
• 3.4.1 刺槐根部提取的總RNA質(zhì)量檢測51-52
• 3.4.2 抑制差減雜交結(jié)果分析52-53
• 3.4.3 差減cDNA文庫的構(gòu)建53-54
• 3.4.4 斑點(diǎn)雜交的結(jié)果54-55
• 3.5 討論55-56
• 第四章 刺槐結(jié)瘤相關(guān)基因克隆及表達(dá)譜分析56-76
• 4.1 引言56-57
• 4.2 材料、試劑和儀器57
• 4.2.1 材料57
• 4.2.2 試劑57
• 4.2.3 儀器57
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法57-63
• 4.3.1 測序及序列的生物信息學(xué)分析57-58
• 4.3.2 候選基因半定量RT-PCR分析58-59
• 4.3.3 候選基因熒光定量RT-PCR分析59-61
• 4.3.4 候選基因的cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)61-63
• 4.3.5 序列分析63
• 4.4 結(jié)果與分析63-72
• 4.4.1 序列測定及提交63
• 4.4.2 正反交文庫中ESTs的比對和功能分類63-65
• 4.4.3 候選基因的時(shí)空表達(dá)分析65-69
• 4.4.4 RACE產(chǎn)物的克隆測序及目的基因全長cDNA的獲取69-72
• 4.5 討論72-76
• 4.5.1 參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的候選基因72-74
• 4.5.2 參與到翻譯后修飾的候選基因74-75
• 4.5.3 候選的參與信號通路的膜蛋白基因75-76
• 第五章 五個(gè)晚期結(jié)瘤素基因的鑒定及功能驗(yàn)證76-96
• 5.1 引言76
• 5.2 材料、試劑和儀器76-77
• 5.2.1 材料76
• 5.2.2 試劑76-77
• 5.2.3 儀器77
• 5.3 實(shí)驗(yàn)方法77-81
• 5.3.1 五個(gè)候選晚期結(jié)瘤素基因77
• 5.3.2 刺槐發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系建立77-81
• 5.4 結(jié)果與分析81-95
• 5.4.1 候選基因的時(shí)空表達(dá)及分析81-86
• 5.4.2 RNA干擾載體的構(gòu)建86-88
• 5.4.3 RNA干擾效果鑒定88-95
• 5.5 討論95-96
• 第六章 結(jié)論與創(chuàng)新96-100
• 6.1 結(jié)論96-98
• 6.1.1 記錄刺槐結(jié)瘤過程96
• 6.1.2 差減cDNA文庫的構(gòu)建96
• 6.1.3 刺槐結(jié)瘤相關(guān)ESTs生物信息學(xué)分析與qRT-PCR驗(yàn)證96-97
• 6.1.4 五個(gè)結(jié)瘤特異性基因的鑒定及功能驗(yàn)證97-98
• 6.2 創(chuàng)新點(diǎn)98-100
• 參考文獻(xiàn)100-115
• 附錄115-134
• 縮略詞134-135
• 致謝135-136
• 個(gè)人簡介136

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本文編號：331038