本文關鍵詞：刺糖多孢菌功能蛋白質組及其多殺菌素產生代謝調控網絡的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：微生物合成次級代謝產物的生理過程受到細胞中一系列精細、復雜及有序的代謝調控,探究合成途徑中的關鍵調控因子,成為次級代謝產物產生代謝調控網絡研究的熱點。近年來,微生物次級代謝產物產生代謝調控網絡的研究逐步與蛋白質組學研究相結合,蛋白質組學技術被廣泛用于鑒定和監(jiān)測微生物蛋白質組中的蛋白質種類及其表達豐度的變化趨勢,挖掘次級代謝產物合成過程中的潛在調控因子,獲取其代謝調控網絡信息。放線菌刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)是一種能產生以多殺菌素為主要次級代謝產物的革蘭陽性菌,經有氧發(fā)酵產生的大環(huán)內酯類次級代謝產物多殺菌素能有效殺滅多種農業(yè)害蟲。目前,雖然催化多殺菌素生物合成的基因簇及其生物合成代謝通路的相關研究取得進展,但是與其合成相關的代謝調控通路的研究報道較少。為了探索多殺菌素生物合成過程中的潛在調控因子和調控機制,本研究對刺糖多孢菌CCTCC M206084菌株不同生長時期的蛋白質組進行了系統(tǒng)的比較分析。利用二維液質聯(lián)用質譜(Two-dimensional-liquid chromatography-tandem mass spectrometry,2D-LC-MS/MS)分別從對數(shù)生長期(T1)、穩(wěn)定期前期(T2)、穩(wěn)定期后期(T3)和衰亡期(T4)鑒定到1090、1166、701和509種蛋白質。在這些鑒定到的蛋白質中,1579種蛋白質特異性的屬于刺糖多孢菌蛋白質組中。其中,幾乎所有參與多殺菌素生物合成的酶類都被鑒定到。利用PAI值分析了蛋白質在不同生長時期的表達豐度變化趨勢,發(fā)現(xiàn)一系列壓力響應蛋白和潛在的全局性調控因子在多殺菌素的合成過程中表達豐度差異顯著。隨后,利用qRT-PCR技術分析了glnA、metE、spnK、psda和cndp等基因在不同生長時期的轉錄水平,顯示所選擇的目的基因在轉錄水平和翻譯水平上的差異具有正相關關系。本研究首次系統(tǒng)性地分析了刺糖多孢菌發(fā)酵過程中蛋白質組的變化,其蛋白質組學數(shù)據(jù)為多殺菌素合成代謝調控網絡的研究奠定了基礎。對潛在調控基因進行阻斷,觀察突變菌株相對于原始菌株所體現(xiàn)的表型差異,是研究該基因生物學功能的重要手段之一。鈷胺素非依賴型甲硫氨酸合成酶(cobalamin-independentmethioninesynthase,mete)是催化甲硫氨酸生物合成最后一個步驟的關鍵酶。在前期的功能蛋白質組學研究工作中,發(fā)現(xiàn)mete在刺糖多孢菌中的表達豐度隨著發(fā)酵過程中多殺菌素的累積而顯著上調,推測該酶除了直接參與甲硫氨酸的合成外,對于多殺菌素的生物合成可能具有正調控作用。為了探究mete的對于多殺菌素生物合成的重要性,本研究利用單交換同源重組的方法對mete蛋白的編碼基因mete進行阻斷,成功獲得了Δmete突變菌株。與野生型刺糖多孢菌相比,Δmete突變菌株在液體發(fā)酵培養(yǎng)基和固體平板上都體現(xiàn)出較快的生長速率;在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,Δmete突變菌株不再同野生型刺糖多孢菌一樣具有兩次生長的特性,只具有一個較長的穩(wěn)定生長期;Δmete突變菌株僅產生少量的多殺菌素,其產量相較于野生型刺糖多孢菌下降幅度超過95%;在tsb固體培養(yǎng)基上,野生型刺糖多孢菌能產生白色的孢子,而Δmete突變菌株喪失了產孢子的能力。因此,推測mete基因的阻斷引起了刺糖多孢菌新陳代謝的較大紊亂,影響了多殺菌素的生物合成和孢子的生長發(fā)育。利用比較蛋白質組學分析目的基因突變菌株與野生型菌株蛋白質組表達圖譜的差異,可以探究目的功能基因所控制和影響的調控路徑或代謝通路,闡明所阻斷目的基因的重要生物學功能及代謝調控機制。為了剖析刺糖多孢菌對mete基因阻斷后所體現(xiàn)的新陳代謝適應機制,本研究利用無標記定量蛋白質組學技術分析了Δmete突變菌株和野生型菌株的蛋白質組差異。從Δmete突變菌株的穩(wěn)定期初期(s1Δmete,67h)、野生型菌株的第一個穩(wěn)定期(s1wt,67h)和第二個穩(wěn)定期(s2wt,100h)中分別鑒定到1141、1066和987種蛋白質,共檢測到刺糖多孢菌蛋白質組中1440種蛋白質。利用emPAI值對所鑒定到的蛋白質進行半定量分析,以野生型刺糖多孢菌的兩組蛋白質組樣本為參照,重點關注蛋白質表達豐度在比較組S1ΔmetE/S1WT和S1ΔmetE/S2WT中的變化趨勢,分析了ΔmetE突變菌株與野生型刺糖多孢菌的蛋白質組差異。結果顯示,大部分具有顯著上下調趨勢的蛋白質屬于初級代謝和基因信息過程功能類別。同時,詳細闡述了參與葡萄糖代謝和氨基酸代謝(甲硫氨酸、天冬氨酸和谷氨酸)酶類所體現(xiàn)的復雜代謝適應機制。本研究首次說明MetE不僅是直接參與甲硫氨酸合成的酶,也對刺糖多孢菌的全局性代謝調控具有重要影響。綜上所述,本文對刺糖多孢菌不同生長時期的功能蛋白質組進行了比較分析;研究了metE基因阻斷后對刺糖多孢菌表型和生長特性的影響;利用蛋白質組學技術剖析了刺糖多孢菌對metE基因阻斷的新陳代謝適應機制。研究結果為進一步闡明刺糖多孢菌產多殺菌素的代謝調控網絡奠定了基礎,也彰顯了蛋白質組學技術在微生物次級代謝產物合成調控機制研究中的重要地位。
【關鍵詞】：刺糖多孢菌 多殺菌素 功能蛋白質組 鈷胺素非依賴型甲硫氨酸合成酶 基因阻斷 代謝調控網絡
【學位授予單位】：湖南師范大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q936
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRCT7-15
• 第一章 緒論15-37
• 1.1 微生物次級代謝產物代謝調控的研究15-24
• 1.1.1 放線菌次級代謝產物代謝調控研究的策略16-21
• 1.1.2 多殺菌素產生代謝調控網絡的研究進展21-24
• 1.2 蛋白質組學在微生物次級代謝產物代謝調控研究中的應用24-34
• 1.2.1 蛋白質組學的主要研究技術24-32
• 1.2.2 蛋白質組學在次級代謝產物合成調控研究中的應用32-34
• 1.3 立題依據(jù)和意義34-36
• 1.4 研究技術路線36-37
• 第二章 刺糖多孢菌不同生長發(fā)育時期蛋白質組研究37-62
• 2.1 引言37-38
• 2.2 材料與方法38-46
• 2.2.1 菌株及培養(yǎng)條件38
• 2.2.2 生理特性的研究38-39
• 2.2.3 全菌體蛋白質的提取及SDS-PAGE檢測39-40
• 2.2.4 蛋白質的胰蛋白酶酶解40
• 2.2.5 質譜鑒定酶解肽段40-43
• 2.2.6 蛋白質數(shù)據(jù)庫搜索43
• 2.2.7 Label-free半定量分析蛋白質表達豐度差異43-44
• 2.2.8 qRT-PCR檢測44-46
• 2.3 結果與分析46-60
• 2.3.1 刺糖多孢菌生長特性分析46-47
• 2.3.2 刺糖多孢菌功能蛋白質組47-51
• 2.3.3 生長過程的壓力響應和氧化還原平衡51-52
• 2.3.4 初級代謝52-54
• 2.3.5 全局性調控因子54-56
• 2.3.6 多殺菌素的生物合成56-59
• 2.3.7 qRT-PCR驗證59-60
• 2.4 討論60-62
• 第三章 突變菌株S. spinosa ΔmetE的構建及其生理特性62-79
• 3.1 引言62-63
• 3.2 材料與方法63-67
• 3.2.1 菌株及培養(yǎng)條件63-64
• 3.2.2 metE基因的克隆及載體pOJ260-metE的構建64-65
• 3.2.3 接合轉移及突變菌株S. spinosa ΔmetE的鑒定65-66
• 3.2.4 生理特性研究66-67
• 3.3 結果與分析67-77
• 3.3.1 載體pOJ260-metE的構建及驗證67-68
• 3.3.2 突變株S. spinosa ΔmetE的構建及驗證68-73
• 3.3.3 metE基因阻斷后在液體培養(yǎng)基中的生長差異73-75
• 3.3.4 metE基因敲除后對菌株產孢子情況的影響75-77
• 3.3.5 接合子的遺傳穩(wěn)定性77
• 3.4 討論77-79
• 第四章 蛋白質組學技術剖析S. spinosa對metE基因阻斷的新陳代謝適應79-101
• 4.1 引言79-80
• 4.2 材料與方法80-83
• 4.2.1 菌株及培養(yǎng)條件80
• 4.2.2 蛋白質的提取及SDS-PAGE分析80
• 4.2.3 菌體全蛋白的胰蛋白酶酶解80
• 4.2.4 2D-LC-MS/MS鑒定80
• 4.2.5 數(shù)據(jù)處理80-81
• 4.2.6 蛋白質半定量及生物信息學分析81
• 4.2.7 Western blotting鑒定81-83
• 4.3 結果與分析83-99
• 4.3.1 全局性比較蛋白質組學分析83-84
• 4.3.2 功能分類84-87
• 4.3.3 糖酵解與TCA87-90
• 4.3.4 磷酸戊糖途徑及ED途徑90-91
• 4.3.5 糖異生作用91-92
• 4.3.6 谷氨酸和天冬氨酸代謝92-93
• 4.3.7 甲硫氨酸代謝及SAM循環(huán)93-96
• 4.3.8 Western blotting驗證96-99
• 4.4 討論99-101
• 第五章 研究結論與展望101-104
• 5.1 主要研究結論101-102
• 5.2 展望102-104
• 參考文獻104-119
• 附錄119-133
• 論文發(fā)表情況133-134
• 致謝134-135
• 本論文感謝以下基金項目的資助135

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 秦為輝;李麗;張曉琳;陳新;郭偉群;李能威;;響應曲面分析方法優(yōu)化發(fā)酵液中多殺菌素的提取工藝[J];天然產物研究與開發(fā);2011年02期

2 羅玉雙;夏立秋;黃t，

本文編號：292797