本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)錄因子p8調(diào)控自噬的功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：細(xì)胞自噬是一種在進(jìn)化上高度保守的、維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的生理過程,可以使細(xì)胞內(nèi)部的長壽命蛋白、受損的細(xì)胞器等通過溶酶體降解。自噬與去除和降解錯誤折疊的蛋白質(zhì)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有著重要的聯(lián)系,然而對于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在受到脅迫時如何引發(fā)和調(diào)控自噬的分子機(jī)制還不是完全清楚。很多研究表明磷酸化的腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)和雷帕霉素靶蛋白質(zhì)(TOR)在自噬的調(diào)控中起著關(guān)鍵的作用。自噬對細(xì)胞生長、發(fā)育、再生、退行性疾病等的調(diào)控已經(jīng)被廣泛研究,但是在靜息的細(xì)胞中,自噬調(diào)控的方式仍不清楚。由于鹵蟲在環(huán)境惡劣的條件下可以產(chǎn)生長時間靜息的休眠胚胎,因此我們選擇鹵蟲作為研究模型。我們發(fā)現(xiàn),卵生途徑中,休眠胚胎形成前期,自噬水平逐漸升高,而在休眠胚胎中自噬基本檢測不到。Western blotting和RNA干涉檢測的結(jié)果表明,卵生鹵蟲自噬并不是AMPK/TOR調(diào)控的。同時我們發(fā)現(xiàn)與應(yīng)激相關(guān)的小分子轉(zhuǎn)錄因子p8 (Ar-p8)的表達(dá)特征與休眠胚胎形成過程中自噬的變化水平相一致,在休眠胚胎形成前期高量表達(dá),但是在休眠胚胎中消失,暗示Ar-p8很可能與休眠胚胎形成過程中的自噬調(diào)控相關(guān)。使用雙鏈RNA將休眠胚胎形成前期的Ar-p8干涉后,發(fā)現(xiàn)與對照組高水平的自噬相比,干涉Ar-p8組自噬降低,同時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬相關(guān)的分子轉(zhuǎn)錄因子4(ATF4)和轉(zhuǎn)錄因子6(ATF6)降低。進(jìn)一步我們在人胃癌細(xì)胞系MKN45中過表達(dá)Ar-p8和人源轉(zhuǎn)錄因子p8 (Hu-p8),發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Ar-p8和Hu-p8后腫瘤細(xì)胞自噬水平升高,但是AMPK/mTOR信號通路并不發(fā)生變化。同時,我們分別使用平衡鹽緩沖液(EBSS)和棕櫚酸(PA)對細(xì)胞進(jìn)行脅迫處理,得到營養(yǎng)缺乏和脂肪毒性脅迫的細(xì)胞,引發(fā)自噬。Western blotting的結(jié)果顯示AMPK/mTOR參與調(diào)控由營養(yǎng)缺乏引發(fā)的自噬,而脂肪毒性引發(fā)的自噬則是經(jīng)由Hu-p8調(diào)控的。進(jìn)一步的研究顯示,AMPK/mTOR參與調(diào)控parkin介導(dǎo)的線粒體自噬,而Hu-p8參與調(diào)控由PERK/ATF6介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬。最后我們的研究確認(rèn)了一條由細(xì)胞脂肪毒性引起的非AMPK/mTOR非依賴的自噬途徑：在腫瘤細(xì)胞中,Hu-p8通過介導(dǎo)p53和PKCa參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬的調(diào)控。我們在鹵蟲休眠胚胎形成過程中的研究為進(jìn)一步揭示靜息細(xì)胞的自噬調(diào)控起到重要的作用,同時在腫瘤細(xì)胞中對自噬的研究為應(yīng)對脂肪毒性引發(fā)的自噬提供了重要的理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：自噬 鹵蟲 AMPK/TOR p8 MK<N45 脂肪毒性 營養(yǎng)缺乏
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q255
【目錄】：

• 致謝6-7
• 摘要7-9
• Abstract9-16
• 縮略詞和術(shù)語表16-18
• 1 緒論18-28
• 1.1 研究背景18-27
• 1.1.1 鹵蟲概況18-19
• 1.1.2 胞自噬概況19-24
• 1.1.3 自噬調(diào)控信號通路的研究概況24-26
• 1.1.4 p8的研究概況26-27
• 1.2 展望27
• 1.3 研究目的、方法、意義27-28
• 2 材料與方法28-52
• 2.1 材料28-29
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料28
• 2.1.2 主要試劑28-29
• 2.1.3 主要儀器29
• 2.2 方法29-52
• 2.2.1 總RNA提取29-30
• 2.2.2 cDNA的合成30-31
• 2.2.3 分子克隆31-36
• 2.2.4 蛋白的原核表達(dá)與純化36-37
• 2.2.4.1 檢測表達(dá)產(chǎn)物是以可溶性物質(zhì)還是以包涵體形式存在36
• 2.2.4.2 使用Ni珠純化含有His標(biāo)簽的融合蛋白36-37
• 2.2.5 抗體制備37
• 2.2.6 Western blotting37-39
• 2.2.6.1 總蛋白提取37-38
• 2.2.6.2 蛋白樣品檢測及轉(zhuǎn)膜38
• 2.2.6.3 抗體檢測38-39
• 2.2.7 膠體金偶聯(lián)免疫組化39-40
• 2.2.8 氨基酸序列比對,進(jìn)化分析40
• 2.2.9 鹵蟲dsRNA干涉40-42
• 2.2.9.1 dsRNA表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建40
• 2.2.9.2 小量質(zhì)粒抽提40-41
• 2.2.9.3 dsRNA的誘導(dǎo)表達(dá)及抽提41-42
• 2.2.9.4 鹵蟲的顯微注射42
• 2.2.10 核質(zhì)分離42-43
• 2.2.11 熒光定量PCR43
• 2.2.12 真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及抽提43-44
• 2.2.13 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及藥物處理44-46
• 2.2.14 流式細(xì)胞分選46-47
• 2.2.15 siRNA干涉47-50
• 2.2.15.1 siRNA合成47-49
• 2.2.15.2 siRNA轉(zhuǎn)染49-50
• 2.2.15.3 半定量PCR50
• 2.2.16 細(xì)胞免疫熒光50-52
• 3 結(jié)果52-71
• 3.1 鹵蟲兩種不同發(fā)育模式中自噬水平的分析52-56
• 3.1.1 Ar-ATG5和Ar-ATG8序列獲得52-54
• 3.1.2 鹵蟲兩種生殖方式中自噬的特征分析54-56
• 3.2 AMPK/TOR和Ar-p8分別調(diào)控鹵蟲兩種生殖方式的自噬56-61
• 3.2.1 鹵蟲兩種生殖方式中AMPK/TOR的蛋白水平分析56-57
• 3.2.2 鹵蟲休眠胚胎形成過程中Ar-p8調(diào)控自噬的分子機(jī)制57-59
• 3.2.3 鹵蟲Ar-p8調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬的分析59-60
• 3.2.4 鹵蟲受到環(huán)境脅迫時引發(fā)AMPK/TOR調(diào)控的自噬60-61
• 3.3 p8誘導(dǎo)人胃癌MKN45細(xì)胞自噬水平上升61-64
• 3.3.1 Ar-p8在人胃癌MKN45細(xì)胞中引發(fā)AMPK/mTOR不依賴的自噬61-62
• 3.3.2 Hu-p8在人胃癌MKN45細(xì)胞中引發(fā)AMPK/mTOR不依賴的自噬62-64
• 3.4 Hu-p8調(diào)控由脂肪毒性引發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬64-71
• 3.4.1 AMPK/mTOR和Hu-p8分別調(diào)控由營養(yǎng)缺乏和脂肪毒性引發(fā)的自噬64-67
• 3.4.2 營養(yǎng)缺乏引起線粒體自噬,脂肪毒性引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬67
• 3.4.3 Hu-p8調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬的分子機(jī)制67-71
• 4 討論71-75
• 4.1 極低水平的自噬對鹵蟲休眠胚胎維持靜息狀態(tài)的重要作用71
• 4.2 Ar-p8調(diào)控的自噬可能是與休眠胚胎形成相關(guān)的主動調(diào)控的自噬71-73
• 4.3 p8對自噬的調(diào)控作用73
• 4.4 營養(yǎng)缺乏和脂肪毒性引發(fā)不同類型的自噬73-75
• 5 結(jié)論75
• 6 展望75-76
• 參考文獻(xiàn)76-83
• 附錄一 論文中使用的引物83-87
• 附錄二 常用試劑配制87-93
• 作者簡介93-94

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本文編號：292751