本文關鍵詞：水稻粒寬基因GS5的調控與分子機理研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：水稻是最重要的糧食作物之一,如何提高水稻產量一直是科學研究與育種研究長期關注的重點。水稻產量由單位面積穗數(shù)、每穗實粒數(shù)和千粒重三個因素構成,千粒重由穎殼的體積和胚乳發(fā)育狀況兩個因素決定,對穎殼形狀與體積的描述一般稱為粒形,包括粒長、粒寬和粒厚,因此,粒形是重要的產量性狀之一。前人通過圖位克隆法分離到GS5,它是第五染色體上的一個正調控粒寬、粒重和灌漿速率的微效基因,窄粒等位基因GS5-H94與寬粒等位基因GS5-ZS97之間的差異主要是啟動子區(qū)存在的18個多態(tài)性位點造成兩者表達水平的高低不同。提高GS5的表達量可以增加粒寬,因為GS5影響了一系列細胞周期調控基因的表達,GS5表達量的提高可以促進穎殼細胞分裂,增加穎殼細胞數(shù)目�；谶@些認識,本研究通過對以下四個問題的分析,進一步探討GS5的表達調控和分子機理。首先,啟動子區(qū)的多態(tài)性位點會造成怎樣的表達模式差異?其次,啟動子區(qū)的多態(tài)性位點為什么會造成這樣的表達模式差異?第三,為什么GS5的表達水平與粒寬正相關?最后,GS5在水稻馴化過程中發(fā)生了怎樣的故事?主要結果如下:1.GS5在綠色組織中的表達水平遠高于非綠色組織,在非綠色組織中表達量最高的是發(fā)育中的幼穗。在幼穗發(fā)育過程中寬粒等位基因GS5-ZS97的表達量高于窄粒等位基因GS5-H94,而在綠色組織中GS5-H94的表達量反而更高,暗示GS5的表達受到至少兩種不同因素的調控。2.GS5啟動子的順式作用元件大部分是光響應元件,兩個等位基因的多態(tài)性位點主要造成光響應元件的數(shù)量不同,GS5-H94含有更多的光響應元件。研究證實GS5的表達受光照誘導,并在一天中表現(xiàn)出節(jié)律性變化。GS5-H94受光照誘導后表達量的改變更為劇烈,因此,可以解釋GS5在綠色組織中高表達,且GS5-H94的表達量高于GS5-ZS97。3.利用一系列截短與定點誘變的啟動子-GUS(β-Glucuronidase)片段分析造成幼穗中表達量差異的關鍵位點,發(fā)現(xiàn)啟動子 1139 bp至 931 bp(記為B區(qū))對GS5的差異表達具有最關鍵的影響。比較GS5-H94、GS5-ZS97與來自寬粒品種中花11的第三種單倍型gs5-zh11的啟動子 1139bp至 604bp區(qū)段(b、c區(qū)),鑒定出gs5-h94特有的三個snps(snp_ 1109,snp_ 1032和snp_ 825),將gs5-zs97的snp_ 1109和snp_ 1032誘變?yōu)間s5-h94基因型可將其啟動子強度降低到gs5-h94水平上。4.啟動子b區(qū)的snp_ 1109和snp_ 1032位于一個ga(gibberellin)響應元件側翼,c區(qū)的snp_ 825造成兩個等位基因產生一個光響應元件的差異。將ga響應元件誘變缺失后,啟動子強度上升,表明ga響應元件的作用是抑制表達;將光響應元件誘變后,啟動子強度下降,表明光響應元件的作用是促進表達;在幼穗中,ga響應元件對啟動子強度的影響更大。激素處理結果表明gs5的表達不受ga影響,但aba(abscisicacid)對gs5-h94的表達有明顯的抑制作用,對gs5-zs97的影響則不明顯,從而造成gs5-h94的表達量低于gs5-zs97。5.gs5是一種絲氨酸羧肽酶類蛋白,gs5-h94和gs5-zs97的蛋白質功能沒有差異,表達量的提高都可以使粒寬增加。gs5是分泌性蛋白質,定位于細胞表面,與細胞膜之間存在密切聯(lián)系。過量表達時有相當一部分gs5蛋白滯留在內質網中。6.酵母雙雜交篩選到gs5可與細胞膜蛋白osbak1-7(擬南芥bak1(bri1-associatiedkinase1)的同源基因)的胞外lrr(leucine-richrepeat)結構域互作。如同擬南芥的報道,osbak1-7的lrr結構域也可與osmsbp1(擬南芥msbp1(membranesteroid-bindingprotein1)的同源基因)互作,這種互作會促進osbak1-7的內吞。本研究表明當細胞表面存在大量的gs5蛋白時,gs5與osbak1-7的互作會競爭性抑制后者與osmsbp1的互作,從而阻止osbak1-7的內吞。這種競爭性互作可以在一定程度上解釋為什么gs5的表達水平與表型正相關。7.gs5的表達受到br(brassinosteroids)的抑制;擬南芥br信號轉導途徑中的一個絲氨酸羧肽酶brs1在水稻中的超表達也可使粒寬增加,且粒寬也與其表達水平正相關;加上gs5與osbak1-7的互作關系,暗示gs5很可能通過br信號轉導途徑調控穎殼細胞分裂和粒寬。osbak1-7超表達后植株半矮,莖稈變細,缺失突變體株高增加,莖稈變粗,可能對水稻生長具有一定的抑制作用,但粒形沒有變化;osmsbp1在各個組織時期都有很高的表達,其缺失突變體成苗率極低,絕大部分在萌發(fā)后死亡,植株矮化、分蘗減少、粒形變小,表明它對水稻生長有必不可缺的作用。這兩個基因在BR信號轉導中的作用還需進一步研究,目前的初步結果認為它們對水稻生長的作用是相反的,GS5通過對它們互作平衡的調節(jié)實現(xiàn)對表型的控制。8.對527份核心種質材料和17份野生稻材料進行GS5的比較測序,從ATG上游2 kb到3’-UTR共6.4 kb的區(qū)間內鑒定出130個SNPs和27個InDels,其中70%以上的多態(tài)性位點分布在2 kb的啟動子區(qū)。根據(jù)這些多態(tài)性位點可將GS5分成49個單倍型(Haplotype),歸為12個單倍群(Haplogroup)。一共鑒定出10種完整形式的GS5蛋白類型,它們之間只有少數(shù)氨基酸的差異,沒有發(fā)現(xiàn)提前終止的類型,其中GS5-P2(即GS5-H94)是最古老的蛋白質類型,GS5-P1(即GS5-ZS97)形成較晚。9.四大單倍群中,GS5-1型(即GS5-ZS97型)和GS5-2型(即GS5-H94型)主要分布在秈稻中,GS5-3型(即GS5-ZH11型)主要分布在粳稻中,GS5-4型主要分布在aus稻中。由于群體結構的存在,只能比較秈稻中GS5-1型和GS5-2型材料的粒形差異,為了剔除同一染色體上粒寬主效基因qSW5/GW5的效應影響,對其基因型進行鑒定。結果發(fā)現(xiàn)相同qSW5/GW5基因型的材料中GS5-1型和GS5-2型材料的粒寬沒有顯著差異,表明GS5的微弱效應在自然群體中被掩蓋了。10.在秈稻IndI亞群中檢測到GS5的Tajima’s D值顯著小于0,π值非常低,且該亞群中絕大部分是GS5-1型材料,暗示形成較晚的GS5-1可能受到人工選擇,但其微弱的效應似乎不太可能被人類發(fā)現(xiàn)和選擇。分析發(fā)現(xiàn)Rc或Wx等馴化基因的突變并不影響GS5-1和GS5-2的基因型頻率,但當qSW5/GW5位點發(fā)生突變,產生顯著的大粒表型后,GS5-1的基因型頻率便大大上升。由于GS5與qSW5/GW5位點之間相距僅2 Mb并存在一個連鎖不平衡區(qū)域(LD block),表明GS5位點受到qSW5/GW5位點受選擇的搭載效應影響,而且秈稻中qsw5/gw5的突變發(fā)生在GS5-1的背景下。
【關鍵詞】：微效基因 差異表達 順式作用元件 啟動子強度 絲氨酸羧肽酶類蛋白 OsBAK1 OsMSBP1 競爭性互作 核心種質 qSW5/GW5 人工選擇 搭載效應
【學位授予單位】：華中農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q943.2
【目錄】：

• 摘要8-11
• Abstract11-15
• 縮略語表15-16
• 1. 前言16-39
• 1.1 調控水稻粒形與粒重的基因16-21
• 1.1.1 水稻粒形與粒重QTL的克隆16-19
• 1.1.2 油菜素內酯對粒形粒重的影響19-21
• 1.2 植物器官大小的決定21-29
• 1.2.1 植物器官的構成和形成21-22
• 1.2.2 細胞行為與器官大小22-27
• 1.2.3 有限生長——度的把握27-29
• 1.3 絲氨酸羧肽酶類蛋白的研究進展29-32
• 1.3.1 絲氨酸羧肽酶類蛋白的特點29-30
• 1.3.2 絲氨酸羧肽酶類蛋白的功能30-32
• 1.4 植物BR信號轉導研究進展32-37
• 1.4.1 細胞膜表面受體BRI132-33
• 1.4.2 BRI1 的互作蛋白33-34
• 1.4.2.1 BRI1 輔助受體BAK133
• 1.4.2.2 BRI1 抑制子BKI133-34
• 1.4.2.3 BSKs與下游信號轉導34
• 1.4.3 恢復bri1 突變表型的其它基因34-36
• 1.4.3.1 絲氨酸羧肽酶BRS134-36
• 1.4.3.2 內質網系統(tǒng)相關基因36
• 1.4.4 BRI1 與BAK1 的內吞36-37
• 1.5 工作基礎與研究內容37-39
• 1.5.1 前人的研究基礎37-38
• 1.5.2 本研究擬解決的問題38-39
• 2. 材料與方法39-49
• 2.1 材料來源39
• 2.2 序列分析39-40
• 2.3 載體構建與測序40-41
• 2.4 水稻遺傳轉化與表型鑒定41-44
• 2.4.1 農桿菌介導的水稻遺傳轉化41
• 2.4.2 轉基因植株的陽性檢測41-44
• 2.4.3 植株表型考查44
• 2.5 外源基因的瞬時表達44-45
• 2.5.1 農桿菌介導的煙草葉片瞬時表達44
• 2.5.2 煙草BY-2 原生質體轉化44-45
• 2.6 目標基因的表達檢測45-47
• 2.6.1 RNA的抽提、反轉錄與Real-time PCR45
• 2.6.2 激光共聚焦顯微鏡檢測熒光蛋白45-46
• 2.6.3 總蛋白的抽提與GUS活性定量測定46
• 2.6.4 Western blot檢測目標蛋白46-47
• 2.7 目標蛋白的異源表達47-48
• 2.7.1 原核表達47
• 2.7.2 畢赤酵母表達47-48
• 2.8 酵母雙雜交篩選互作蛋白48-49
• 3. 結果與分析49-115
• 3.1 GS5 的表達模式分析49-52
• 3.2.1 GS5 的全生育期表達譜49-51
• 3.2.2 GS5 在穎殼和胚乳發(fā)育過程中的表達模式51-52
• 3.2.3 GS5 在葉片中的表達模式52
• 3.2 GS5 表達的調控因素52-63
• 3.2.1 啟動子順式作用元件分析52-55
• 3.2.2 光照對GS5 表達的影響55-58
• 3.2.3 造成幼穗中GS5 差異表達的關鍵位點58-61
• 3.2.4 激素對GS5 表達的影響61-63
• 3.3 GS5 蛋白的性質分析63-73
• 3.3.1 GS5 蛋白氨基酸序列的分析63-67
• 3.3.2 GS5 蛋白的異源表達67-68
• 3.3.2.1 GS5 蛋白的原核表達67
• 3.3.2.2 GS5 蛋白的畢赤酵母表達67-68
• 3.3.3 水稻中超表達GS5-FLAG68-71
• 3.3.3.1 GS5-FLAG蛋白的純化與分析68
• 3.3.3.2 GS5-H94 蛋白和GS5-ZS97 蛋白的功能比較68-69
• 3.3.3.3 GS5 發(fā)揮功能可能不需要活性的發(fā)揮69
• 3.3.3.4 GS5 特異控制粒寬69-71
• 3.3.4 GS5 蛋白的亞細胞定位71-73
• 3.3.4.1 超表達植株的GS5-GFP定位71
• 3.3.4.2 煙草葉片瞬時表達GS5-GFP71-73
• 3.3.4.3 BY-2 原生質體瞬時表達GS5-GFP73
• 3.4 GS5 蛋白的作用途徑初探73-96
• 3.4.1 利用GS5-BD融合載體篩選酵母雙雜交文庫73-80
• 3.4.1.1 GS5-BD融合載體的自激活活性檢測與酵母毒性檢測73-74
• 3.4.1.2 GS5 分子內的點對點實驗74-75
• 3.4.1.3 GAL4 AD融合文庫篩選75
• 3.4.1.4 BKA篩庫結果分析75
• 3.4.1.5 互作候選基因的點對點驗證75-77
• 3.4.1.6 互作候選基因的表達譜分析77-80
• 3.4.1.7 互作候選基因的亞細胞定位預測80
• 3.4.2 GS5 與OsBAK1 的互作分析80-85
• 3.4.2.1 OsBAK1 序列分析與點對點驗證80-82
• 3.4.2.2 GS5 和OsMSBP1 對OsBAK1 亞細胞定位的影響82-85
• 3.4.3 OsBAK1 和OsMSBP1 的功能初探85-89
• 3.4.3.1 OsBAK1 和Os MSBP1 的表達譜分析85
• 3.4.3.2 OsBAK1 的遺傳材料表型考查85-88
• 3.4.3.3 OsMSBP1 突變體表型考查88-89
• 3.4.4 水稻中超表達AtBRS189-92
• 3.4.4.1 AtBRS1 超表達材料的表型考查89-90
• 3.4.4.2 超表達AtBRS1 和GS5 對BR合成與信號轉導的影響90
• 3.4.4.3 超表達AtBRS1 和GS5 對內質網脅迫相關基因的影響90-92
• 3.4.5 GS5 與OsBRI1 的互作分析92-96
• 3.4.5.1 LRR區(qū)突變的OsBRI1 蛋白的構建92
• 3.4.5.2 GS5 與OsBRI1 的點對點實驗92-93
• 3.4.5.3 GS5 對OsBRI1 亞細胞定位的影響93-96
• 3.5 GS5 的比較測序與進化96-115
• 3.5.1 本室水稻核心種質材料概況96-99
• 3.5.1.1 核心種質材料的原產地96
• 3.5.1.2 核心種質材料的群體結構96
• 3.5.1.3 核心種質材料的粒形多樣性96-99
• 3.5.2 GS5 的核酸多態(tài)性與中性檢測99-105
• 3.5.3 GS5 的單倍型分析105-108
• 3.5.4 qSW5/GW5 的單倍型鑒定108-109
• 3.5.5 GS5 與qSW5/GW5 的關系109-112
• 3.5.6 GS5 的進化模式112-114
• 3.5.7 qsw5/gw5 突變的分布114-115
• 4. 討論115-125
• 4.1 GS5 的表達調控115-116
• 4.2 GS5 是微效基因116-117
• 4.3 GS5 的作用機理117-120
• 4.4 GS5 的進化模式120-121
• 4.5 粒長和粒寬的調控121-123
• 4.6 后續(xù)研究的著手點123-125
• 參考文獻125-136
• 附錄136-176
• 附錄Ⅰ：部分實驗操作步驟136-153
• Protocol 1：感受態(tài)細胞的制備136-137
• Protocol 2：測序反應與產物純化137
• Protocol 3：農桿菌介導的水稻遺傳轉化（粳稻）137-142
• Protocol 4：小樣DNA的抽提142
• Protocol 5：煙草BY-2 原生質體轉化142-144
• Protocol 6：CsCl密度梯度離心純化質粒DNA144-146
• Protocol 7：植物總RNA的抽提與反轉錄146
• Protocol 8：Real-time PCR與結果的分析146-147
• Protocol 9：Bradford法測定蛋白質濃度與GUS活性的定量測定147-149
• Protocol 10：SDS-PAGE與Western blot149-150
• Protocol 11：酵母雙雜交相關實驗150-153
• 附錄Ⅱ：533 份水稻核心種質清單153-169
• 附錄Ⅲ：17 份野生稻材料清單169-170
• 附錄Ⅳ：研究中涉及的引物清單170-175
• 附錄Ⅴ：作者簡介175-176
• 致謝176-178

【參考文獻】

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 李一博;水稻粒形、粒重基因GS5及堊白基因Chalk5的克隆與功能研究[D];華中農業(yè)大學;2011年

  本文關鍵詞：水稻粒寬基因GS5的調控與分子機理研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：272538