發(fā)布時間：2017-03-28 13:20

  本文關鍵詞：擬南芥葡萄糖信號轉導元件AtRGS1和AtHXK1的功能關聯(lián)性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：葡萄糖作為細胞基礎構件分子,能量代謝中樞分子,同時也是重要的信號分子,調控植物生長和發(fā)育的多個方面。擬南芥中HEXOKINASE 1(AtHXK1)和Regulator of G-protein Signaling 1(AtRGS1)是介導葡萄糖信號轉導過程的兩個重要葡萄糖感應器。它們對葡萄糖信號的感應和轉導都不依賴于糖酵解過程。對于分別依賴AtHXK1和AtRGS1的兩條葡萄糖信號轉導途徑的研究都已經獨立開展起來,并已取得重要進展。但是,到目前為止,關于植物體內這兩條信號轉導途徑之間是否存在某種程度的關聯(lián)或者整合,國內外均無相關報道。本研究通過表型上位分析,GUS染色分析,葡萄糖應答基因的表達調控分析,蛋白質的亞細胞重定位分析,以及蛋白質間的相互作用分析等途徑,發(fā)現擬南芥葡萄糖信號轉導元件AtHXK1和AtRGS1之間存在復雜的關聯(lián)性。主要結果如下:1.hxk1突變體和rgs1突變體都表現出對高濃度葡萄糖(6%,重量/體積)抑制幼苗生長發(fā)育過程的弱敏性,但是它們的雙突變體hxk1/rgs1表現出介于兩個單突變體之間的中間型弱敏性,表明AtRGS1和AtHXK1在響應高濃度葡萄糖的這個過程中,并非屬于兩條完全獨立的信號轉導途徑,因為兩者突變體的表型并未出現簡單的疊加現象。2.在根的伸長、葉的擴展等細胞活性相關表型上,hxk1突變體和rgs1突變體存在相反的表型,而它們的雙突變體hxk1/rgs1表現出介于兩個單突變體之間的中間型表型,表明AtHXK1和AtRGS1在細胞活性的調控過程中,存在反饋調控的關系。在單突變體hxk1和rgs1的遺傳背景下,本研究對細胞周期蛋白基因CDKA;1的表達進行了體內分析,結果再次證實了AtRGS1和AtHXK1在調控細胞活性過程中的功能關聯(lián)性。3.對于高濃度的鹽脅迫,hxk1突變體表現出超敏感性,rgs1突變體表現出弱敏感性,而雙突變體hxk1/rgs1表現出類似于rgs1突變體的弱敏感性,表明在鹽脅迫響應過程中,AtRGS1位于AtHXK1的上游,兩者共同調控植物對鹽脅迫的耐受力。4.At RGS1和AtHXK1以兩種不同的模式共同調控葡萄糖應答基因TBL26、CA2和CAB2的表達,這兩種模式與上述單突變體和雙突變體在正常生長環(huán)境,以及高濃度葡萄糖或者鹽脅迫環(huán)境下表現出的表型模式是一致的。5.依賴AtRGS1的葡萄糖信號轉導途徑的第一步——葡萄糖誘導AtRGS1發(fā)生內吞。這個過程在hxk1突變體的背景下并未發(fā)生改變,表明AtHXK1在AtRGS1信號轉導途徑的下游,即AtRGS1內吞后的過程中發(fā)揮功能,這與基因表達調控模型的推測是一致的。6.通過蛋白質互作數據庫分析,發(fā)現AtRGS1和AtHXK1有一個共同的互作蛋白——AtRHIP1。對這個功能未知蛋白進行生物信息學分析,發(fā)現AtRHIP1是一個潛在的信號轉導元件,這為分析AtRGS1和AtHXK1之間的功能關聯(lián)提供了一個直接的節(jié)點。進一步通過雙分子熒光互補途徑,在植物細胞內對AtRGS1和AtHXK1以及AtRHIP1間的蛋白互作進行分析,確認了三者之間的蛋白相互作用。7.通過蛋白質互作數據庫分析,還發(fā)現與AtRGS1存在蛋白質相互作用的另一個重要蛋白——VHA-B3。鑒于VHA-B1在依賴AtHXK1的葡萄糖信號轉導途徑中的潛在重要功能,以及VHA-B1與VHA-B3之間的功能關聯(lián)性,通過雙分子熒光互補手段,在植物細胞內也對AtRGS1和AtHXK1以及VHA-B1/3間的蛋白互作進行了分析,確認了這4個蛋白在植物細胞內的相互作用。8.通過分離鑒定獲得擬南芥AtRHIP1的功能缺失突變體,轉基因獲得AtRHIP1的超表達體。對AtRHIP1的突變體和超表達體進行幼苗的生長發(fā)育和葡萄糖刺激響應分析,以及葡萄糖應答基因的轉錄調控分析,發(fā)現AtRHIP1在依賴AtRGS1和AtHXK1的葡萄糖信號轉導過程中具有潛在的調控作用。綜上所述,擬南芥中依賴AtHXK1的葡萄糖信號轉導途徑和依賴AtRGS1的葡萄糖信號轉導途徑組成了一個復雜的調控網絡,針對具體的葡萄糖應答基因或者相關表型進行特異的調控。在這個過程中,兩個不依賴糖酵解的葡萄糖感應器AtRGS1和AtHXK1相互聯(lián)系,相互協(xié)調,共同對葡萄糖信號進行應答。
【關鍵詞】：擬南芥 AtHXK1 AtRGS1 葡萄糖 信號轉導
【學位授予單位】：東北農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q943.2
【目錄】：

• 摘要10-12
• 英文摘要12-14
• 1 引言14-34
• 1.1 葡萄糖在植物體中的生物學重要性15-21
• 1.1.1 構件分子15-18
• 1.1.2 能量中樞分子18-19
• 1.1.3 信號分子19-21
• 1.2 酵母菌中的葡萄糖信號轉導途徑21-24
• 1.2.1 Hxk2/Snf1/Mig1途徑22-23
• 1.2.2 Snf3/Rgt2-Rgt1途徑23
• 1.2.3 cAMP/PKA途徑23
• 1.2.4 酵母菌葡萄糖信號轉導途徑的整合23-24
• 1.3 擬南芥中的葡萄糖信號轉導途徑24-31
• 1.3.1 依賴AtHXK1的信號轉導途徑26-27
• 1.3.2 依賴AtRGS1的G蛋白信號轉導途徑27-29
• 1.3.3 依賴糖酵解的SnRK1/TOR信號轉導途徑29-31
• 1.3.4 擬南芥葡萄糖信號轉導途徑的整合31
• 1.4 研究的目的意義與技術路線31-34
• 1.4.1 研究目的與意義31-32
• 1.4.2 技術路線32-34
• 2 材料與方法34-54
• 2.1 實驗材料34-39
• 2.1.1 植物材料34
• 2.1.2 質粒載體及菌種34
• 2.1.3 主要實驗試劑和藥品34-35
• 2.1.4 主要儀器35-36
• 2.1.5 引物序列36
• 2.1.6 主要試劑36-38
• 2.1.7 培養(yǎng)基38-39
• 2.1.8 作圖和分析軟件39
• 2.2 實驗方法39-54
• 2.2.1 擬南芥的培養(yǎng)39
• 2.2.2 突變體基因型分析39-41
• 2.2.3 突變體轉錄缺失分析41-42
• 2.2.4 熒光定量PCR42-44
• 2.2.5 幼苗對葡萄糖的敏感性分析44
• 2.2.6 幼苗對鹽脅迫的敏感性分析44-45
• 2.2.7 成株對光的敏感性分析45
• 2.2.8 蛋白質互作網絡分析45
• 2.2.9 蛋白質功能聚類分析45-46
• 2.2.10 蛋白質三維結構分析46
• 2.2.11 雙分子熒光互補（BiFC）分析蛋白質相互作用46-49
• 2.2.12 擬南芥葉肉細胞原生質體瞬時表達49-51
• 2.2.13 浸花法轉化擬南芥51-52
• 2.2.14 AtRGS1-YFP的細胞內吞定量分析52-54
• 3 結果與分析54-92
• 3.1 擬南芥AtHXK1缺失突變體的篩選和鑒定54-55
• 3.2 擬南芥hxk1-3/rgs1-2 雙突變體的獲得55-56
• 3.3 HXK1蛋白和RGS1蛋白在幼苗生長發(fā)育過程中的功能相關性56-67
• 3.3.1 高濃度葡萄糖對幼苗生長發(fā)育的抑制作用56-58
• 3.3.2 不同濃度葡萄糖對幼苗根伸長的作用58-60
• 3.3.3 幼苗葉片的生長發(fā)育60-61
• 3.3.4 葡萄糖在根端分生組織活化中的功能61-63
• 3.3.5 鹽脅迫對幼苗生長發(fā)育的抑制作用63-66
• 3.3.6 幼苗對光強的敏感性分析66-67
• 3.4 AtRGS1和AtHXK1共同調控一系列葡萄糖應答基因的轉錄67-75
• 3.4.1 AtRGS1和AtHXK1共同調控葡萄糖對TBL26基因的誘導67-69
• 3.4.2 AtRGS1和AtHXK1共同調控TBL26基因表達的模型69-70
• 3.4.3 AtRGS1和AtHXK1共同調控葡萄糖對CA2和CAB2基因的抑制70-72
• 3.4.4 AtRGS1和AtHXK1共同調控CA2和CAB2基因表達的模型72-73
• 3.4.5 AtRGS1和AtHXK1在葡萄糖抑制DIN1基因表達中的功能73-74
• 3.4.6 AtRGS1和AtHXK1參與葡萄糖抑制DIN1基因表達的模型74-75
• 3.5 信號通路的上位分析75-77
• 3.6 生物信息學分析AtHXK1與AtRGS1間的關聯(lián)性77-83
• 3.6.1 蛋白互作分析——RHIP177-80
• 3.6.2 蛋白互作分析——VHA-B1/B380-83
• 3.7 擬南芥RHIP1蛋白的亞細胞定位分析83-84
• 3.8 擬南芥RHIP1缺失突變體的篩選和鑒定84-85
• 3.9 擬南芥AtRHIP1超表達體的轉化和鑒定85-86
• 3.10 擬南芥AtRHIP1缺失突變體和超表達體的表型分析86-92
• 3.10.1 擬南芥AtRHIP1缺失突變體和超表達體的生長發(fā)育表型86-88
• 3.10.2 擬南芥AtRHIP1缺失突變體中葡萄糖應答基因的調控88-91
• 3.10.3 擬南芥AtRHIP1缺失突變體背景下的AtRGS1信號途徑91-92
• 4 討論92-98
• 4.1 AtHXK1信號途徑的復雜調控機制92-94
• 4.2 AtRGS1信號途徑的復雜調控機制94-95
• 4.3 AtHXK1信號途徑與AtRGS1信號途徑之間的關聯(lián)95-98
• 5 結論98-100
• 致謝100-102
• 參考文獻102-116
• 攻讀博士學位期間發(fā)表的學術論文116

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1 黃建萍;擬南芥葡萄糖信號轉導元件AtRGS1和AtHXK1的功能關聯(lián)性研究[D];東北農業(yè)大學;2015年

  本文關鍵詞：擬南芥葡萄糖信號轉導元件AtRGS1和AtHXK1的功能關聯(lián)性研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：272370