本文關鍵詞：水稻OsOFP轉錄因子家族基因克隆與功能分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：轉錄因子(Transcription factor)，也稱反式作用因子，能夠與基因啟動子區(qū)的順式作用元件（cis-acting element）相互作用，從而激活或抑制基因轉錄，在植物的生長發(fā)育、形態(tài)建成、抗逆性及次生代謝等方面都起著重要的調控作用。OFP(Ovate Family Proteins)蛋白家族是一類植物所特有的轉錄因子家族，能夠調控植物的生長發(fā)育，在擬南芥和番茄中都有關于OFP轉錄因子功能研究的報道。水稻基因組中含有31個OsOFP轉錄因子基因家族成員，到目前為止，，對水稻OsOFP家族基因功能的研究報道非常少。 在本研究中，通過生物信息學方法對OsOFP家族的基因結構、蛋白質保守結構域和系統(tǒng)發(fā)生進行了分析；利用實時熒光定量PCR技術研究了OsOFP基因的表達模式；利用擬南芥原生質體瞬時轉化對OsOFP蛋白進行了亞細胞定位分析。以農桿菌介導法轉化水稻，獲得了一部分OsOFP家族基因的過量表達的轉基因植株。過表達OsOFP22的轉基因水稻具有較強的表型，進一步研究了OsOFP22基因的功能。此外，構建了OsOFP22原核表達載體，純化到該重組蛋白，為全面認識OsOFP22蛋白的性質及深入研究該基因的生物學功能奠定了基礎。主要研究結果如下： 1.水稻OsOFP轉錄因子家族基因生物信息學分析 染色體定位模式圖顯示，31個OsOFP基因不均等地分布于除了第6和第9以外的其它10條染色體上，且部分基因以串聯(lián)形式排列；系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，AtOFP和OsOFP基因（除了AtOFP17）明顯地聚為四大類；對擬南芥、水稻、玉米和高粱OFP轉錄因子家族基因結構的分析結果表明，大多數(shù)OFP基因無內含子，這說明在植物進化過程中OFP家族基因的結構可能發(fā)生內含子丟失。OsOFP家族基因編碼蛋白質的C端保守性較強，含有保守的OVATE結構域，還預測到未知結構域motif2和motif3。 2.水稻OsOFP轉錄因子家族基因組織表達及激素響應模式分析 水稻OsOFP家族基因在幼葉、幼根、愈傷組織、胚芽鞘、成熟葉片、穎殼、幼穗和灌漿期種子中的表達具有特異性，而且近半數(shù)基因主要在種子發(fā)育時期表達量較高，這說明該家族基因可能參與調控水稻生長發(fā)育的整個過程，尤其是種子發(fā)育過程。利用PlantCARE在線分析了OsOFP家族基因的啟動子區(qū)序列，結果表明：31個OsOFP基因的啟動子區(qū)都含有與胚乳和種子發(fā)育相關的Skn-1基序，部分基因的啟動子區(qū)還含有與胚乳和種子發(fā)育相關的GCN4基序。 3.水稻OsOFP轉錄因子家族基因克隆及植物表達載體構建 利用Gateway技術成功地從粳稻品種“日本晴”中克隆了31個OsOFP基因，通過BP反應構建到入門載體pDNOR上，其中16個OsOFP基因通過LR反應構建到轉錄增強植物表達載體VP64-pCambia1301上，9個OsOFP基因構建到轉錄抑制植物表達載體EAR-pCambia1301上。 4.水稻OsOFP轉錄因子家族基因的遺傳轉化及鑒定 通過農桿菌介導法將10個OsOFP轉錄增強表達載體和6個OsOFP轉錄抑制表達載體成功地轉化水稻。經過遺傳轉化篩選和后期多次basta篩選鑒定，總計獲得了490多個T0代轉基因水稻株系，大部分轉基因水稻已獲得T1種子，部分轉基因水稻已獲得T2、T3代種子。 5.水稻OsOFP轉錄因子家族基因亞細胞定位分析 通過LR反應將構建到入門載體pDNOR上的31個OsOFP基因分別構建到N-端融合黃色熒光蛋白（YFP）報告基因的表達載體上，利用聚乙二醇介導法將亞細胞定位表達載體轉化擬南芥葉片原生質體，分析OsOFP蛋白亞細胞定位。定位結果與WOLF PSORT和CELLO在線預測結果大致相同，OsOFP蛋白定位情況可分為兩類，一類包含24個OsOFP蛋白，定位于細胞核中；另一類包括7個OsOFP蛋白，主要定位于細胞核中，但在細胞質中也有表達。 6. OsOFP22基因功能的研究 與野生型相比，過表達OsOFP22（OsOFP22-OX）的轉基因水稻呈現(xiàn)出莖稈節(jié)間短縮、葉片傾角變小、葉片變短變寬、花藥形態(tài)變短、穗軸變短、莖粗增加、開花時間推遲、籽粒呈短圓型且變厚、變寬；從灌漿期至收獲期，葉片葉綠素含量一直明顯高于對照野生型的。OsOFP22-OX轉基因水稻對GA的敏感性提高，而對BL的敏感性降低，這說明水稻OsOFP22基因可能介導了GA和BR信號傳導途徑的相互作用。 以農桿菌介導法將構建好的OsOFP22RI-1、OsOFP22RI-2和OsOFP22RI-3的RNAi干擾載體分別轉化水稻。通過qRT-PCR分析表明外源導入的OsOFP22RI-1的RNAi片段對OsOFP22基因的轉錄無抑制作用，而外源導入的OsOFP22RI-2和OsOFP22RI-3降低了OsOFP22基因的轉錄水平。分析顯示，OsOFP22RI轉基因水稻的株高、分蘗數(shù)、節(jié)間、稻谷粒長、稻谷粒寬、稻谷粒厚、稻谷粒重、葉長和葉寬等農藝性狀與野生型Kitaake的沒有明顯差異，這說明該家族基因可能存在著功能冗余。 7.水稻OsOFP22蛋白的原核表達及純化 構建了OsOFP22原核表達載體，并轉化到大腸桿菌Transetta (DE3)菌株中，成功地誘導表達了OsOFP22蛋白。通過Ni-NTAAgarose純化了OsOFP22蛋白，為全面認識OsOFP22蛋白的性質、尋找與OsOFP22蛋白相結合的順式作用元件及其調控的下游基因等奠定基礎。
【關鍵詞】：水稻 OFP 表達模式 亞細胞定位 過量表達
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q943.2
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-16
• 第1章 文獻綜述16-27
• 1.1 轉錄因子概述16-21
• 1.1.1 植物轉錄因子的結構和特點17-18
• 1.1.2 植物轉錄因子的分類18-19
• 1.1.3 植物轉錄因子的功能19-20
• 1.1.4 鑒定轉錄因子功能的方法20-21
• 1.2 轉錄因子在水稻株型構建中的功能研究21-24
• 1.3 OFP 轉錄因子研究進展24-25
• 1.4 研究目的和意義25-27
• 第2章 水稻 OsOFP 轉錄因子家族基因生物信息學分析27-41
• 2.1 實驗方法27-28
• 2.1.1 水稻 OsOFP 轉錄因子家族蛋白的基本性質分析27
• 2.1.2 水稻 OsOFP 轉錄因子家族基因的染色體定位27
• 2.1.3 OFP 轉錄因子家族基因的系統(tǒng)進化樹構建27
• 2.1.4 OFP 轉錄因子家族基因的結構分析27-28
• 2.1.5 水稻 OsOFP 轉錄因子家族基因的氨基酸序列分析28
• 2.1.6 水稻 OsOFP 轉錄因子家族基因的蛋白保守結構域分析28
• 2.2 結果與分析28-38
• 2.2.1 水稻 OsOFP 轉錄因子家族基因信息28-29
• 2.2.2 水稻 OsOFP 轉錄因子家族基因的染色體定位29-30
• 2.2.3 水稻和擬南芥 OFP 轉錄因子家族基因的系統(tǒng)進化樹30-31
• 2.2.4 OFP 轉錄因子家族基因的結構31-35
• 2.2.5 水稻 OsOFP 轉錄因子家族基因氨基酸序列分析35-37
• 2.2.6 水稻 OsOFP 轉錄因子家族蛋白保守結構域的分析37-38
• 2.3 討論38-39
• 2.4 小結39-41
• 第3章 水稻 OsOFP 轉錄因子家族基因組織表達及激素響應模式分析41-58
• 3.1 材料與方法41-47
• 3.1.1 實驗材料41-42
• 3.1.2 實驗方法42-47
• 3.2 結果與分析47-55
• 3.2.1 水稻不同組織 RNA 的提取47-48
• 3.2.2 水稻 OsOFP 轉錄因子家族基因組織表達模式分析48-50
• 3.2.3 水稻 OsOFP 轉錄因子家族基因對激素的響應50-53
• 3.2.4 水稻 OsOFP 轉錄因子家族基因啟動子區(qū)順式作用元件的分析53-55
• 3.3 討論55-56
• 3.4 小結56-58
• 第4章 水稻 OsOFP 轉錄因子家族基因克隆及植物表達載體構建58-77
• 4.1 材料與方法58-65
• 4.1.1 實驗材料58-59
• 4.1.2 實驗方法59-65
• 4.2 結果與分析65-74
• 4.2.1 水稻總 RNA 的提取65-66
• 4.2.2 RT-PCR 法擴增水稻 OsOFP 轉錄因子家族基因66-68
• 4.2.3 OsOFP 基因與入門載體 pDONR 的 BP 重組反應68-72
• 4.2.4 pCambia1301-OsOFP 植物表達載體的構建及農桿菌轉化72-74
• 4.3 討論74-76
• 4.4 小結76-77
• 第5章 水稻OsOFP轉錄因子家族基因亞細胞定位分析77-89
• 5.1 材料與方法77-80
• 5.1.1 實驗材料77-78
• 5.1.2 實驗方法78-80
• 5.2 結果與分析80-87
• 5.2.1 水稻 OsOFP 轉錄因子家族成員亞細胞定位預測80-81
• 5.2.2 GW-pENSG-YFP-OsOFP 亞細胞定位表達載體的構建81-82
• 5.2.3 水稻 OsOFP 轉錄因子家族的亞細胞定位82-87
• 5.3 討論87-88
• 5.4 小結88-89
• 第6章 水稻 OsOFP 轉錄因子家族基因的遺傳轉化及鑒定89-105
• 6.1 材料與方法89-99
• 6.1.1 實驗材料89-95
• 6.1.2 實驗方法95-99
• 6.2 結果與分析99-102
• 6.2.1 根癌農桿菌介導的水稻遺傳轉化99-100
• 6.2.2 轉基因水稻基因組 DNA 鑒定100-101
• 6.2.3 轉基因水稻 Western-blot 檢測101-102
• 6.3 討論102-104
• 6.4 小結104-105
• 第7章 水稻 OsOFP22 基因功能研究105-131
• 7.1 材料與方法105-111
• 7.1.1 實驗材料105-106
• 7.1.2 實驗方法106-111
• 7.2 結果與分析111-128
• 7.2.1 OsOFP22-OX 轉基因植株的獲得111-114
• 7.2.2 OsOFP22-OX 轉基因水稻表型特征及主要農藝性狀分析114-123
• 7.2.3 OsOFP22-RNAi 轉基因植株的獲得與表型分析123-128
• 7.3 討論128-129
• 7.4 小結129-131
• 第8章 水稻OsOFP22蛋白的原核表達及純化131-138
• 8.1 材料與方法131-135
• 8.1.1 實驗材料131-132
• 8.1.2 實驗方法132-135
• 8.2 結果與分析135-136
• 8.2.1 OsOFP22 原核表達載體構建及大腸桿菌 Transetta（DE3）轉化135
• 8.2.2 OsOFP22 重組蛋白在原核系統(tǒng)中的表達及純化135-136
• 8.3 討論136-137
• 8.4 小結137-138
• 第9章 全文結論與討論138-142
• 參考文獻142-157
• 研究生期間主要研究成果157-159
• 導師簡介159-160
• 作者簡介160-161
• 致謝161

【參考文獻】

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  本文關鍵詞：水稻OsOFP轉錄因子家族基因克隆與功能分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：259476