發(fā)布時(shí)間：2017-03-18 14:10

  本文關(guān)鍵詞：Shewanella oneidensis呼吸作用對生物被膜形成的影響及其分子基礎(chǔ)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：自然環(huán)境中,細(xì)菌能以多種方式生存并通過響應(yīng)周圍不斷變化的環(huán)境條件,改變其原有的生活方式。當(dāng)細(xì)菌群體的細(xì)胞濃度較高時(shí),細(xì)菌可以在非生物或者活性表面形成固體生物被膜(solid-surface associated biofilm, biofilm),也能聚集在氣液分界面形成氣液生物被膜(air-liquid interface biofilm, pellicle)。細(xì)菌生物被膜的形成由一系列復(fù)雜的生物化學(xué)過程組成,并受到環(huán)境因素的影響和調(diào)控。本課題的研究對象Shewanella oneidensis是一種革蘭氏陰性的兼性厭氧菌,能夠利用一系列無機(jī)物和有機(jī)物作為電子受體進(jìn)行呼吸并廣泛分布于各種自然環(huán)境中。之前關(guān)于S. oneidensis的研究中,在培養(yǎng)基中加入金屬螫合劑EDTA能夠顯著降低其氣液生物被膜的生物量,并且生物被膜的形成在EDTA濃度為0.3mM時(shí)完全被抑制,該現(xiàn)象表明二價(jià)金屬陽離子在氣液生物被膜的成熟中起到重要作用。本研究中,我們以二價(jià)陽離子對氣液生物被膜的影響為切入點(diǎn),將S.oneidensis菌株培養(yǎng)于添加了不同二價(jià)金屬陽離子的24孔板內(nèi),隨后觀察記錄氣液生物被膜的形成情況,發(fā)現(xiàn)二價(jià)鐵離子對氣液生物被膜的形成具有特殊的影響。研究結(jié)果表明,少量的Fe2+對于氣液生物被膜的形成是必要的,而過量的鐵離子(0.3 mM Fe2+或Fe3+)會(huì)導(dǎo)致氣液生物被膜的解體,但并不影響細(xì)菌的有氧生長。通過一系列的實(shí)驗(yàn)我們進(jìn)一步證明,鐵離子對氣液生物被膜的破壞是由于在該培養(yǎng)條件下,S. oneidensis介導(dǎo)了不可溶電子受體鐵氧化合物(Fe3O4、Fe2O3等)的形成。當(dāng)含F(xiàn)e3+的鐵氧化合物形成時(shí),部分有能力形成氣液生物被膜的細(xì)菌傾向于在不可溶電子受體表面形成固體生物被膜,并且優(yōu)先利用該電子受體進(jìn)行呼吸。本課題深入探討了鐵對S. oneidensis氣液生物被膜產(chǎn)生的影響,表明其特殊的呼吸機(jī)制決定了它對于不同呼吸底物的選擇,以及由此產(chǎn)生的生存方式的轉(zhuǎn)變。由于之前的研究已經(jīng)對S. oneidensis的無氧呼吸做了較為深入的探討,因此本課題以上述結(jié)論作為出發(fā)點(diǎn),著眼于有氧呼吸和微氧呼吸中所涉及的末端氧化酶,對S. oneidensis獨(dú)特的呼吸系統(tǒng)和呼吸調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了深入研究。與大多數(shù)細(xì)菌類似,S. oneidensis擁有多種終端氧化酶,包括兩個(gè)血紅素-銅氧化酶(caa3型和cbb3型)和一個(gè)bd型醌醇氧化酶。S. oneidensis能夠在富含層化電動(dòng)勢化合物的環(huán)境中生存,其中的分子機(jī)理是本研究將要探討的另一個(gè)重要問題。研究中我們發(fā)現(xiàn)cbb3型細(xì)胞色素氧化酶在有氧呼吸中占主導(dǎo)地位；而微氧條件下,除cbb3型細(xì)胞色素氧化酶之外,bd型醌醇氧化酶也起到重要作用。與此相反,與線粒體氧化酶同源的caa3型細(xì)胞色素氧化酶表達(dá)量極低,使它在S. oneidensis中幾乎不發(fā)揮作用。此外,cbb3型細(xì)胞色素氧化酶和bd型醌醇氧化酶的表達(dá)受Crp (cAMP受體蛋白)的調(diào)控。這些發(fā)現(xiàn)表明,S. oneidensis對不同氧化還原環(huán)境的適應(yīng)性來自呼吸調(diào)控系統(tǒng)的轉(zhuǎn)換以及caa3型細(xì)胞色素氧化酶的功能缺失。綜上所述,本研究以二價(jià)金屬離子對S. oneidensis氣液界面生物被膜的影響為出發(fā)點(diǎn),探討了S. oneidensis獨(dú)特的呼吸系統(tǒng)對電子受體選擇以及生存方式轉(zhuǎn)變過程的影響,并且對其獨(dú)特的終端氧化酶體系以及呼吸調(diào)控系統(tǒng)進(jìn)行了深入研究。
【關(guān)鍵詞】：Shewanella oneidensis 氣液生物被膜 細(xì)胞色素末端氧化酶 呼吸調(diào)控系統(tǒng) Crp蛋白
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q93
【目錄】：

• 摘要9-11
• Abstract11-14
• 1 緒論14-29
• 1.1 細(xì)菌生物被膜概述14-19
• 1.1.1 細(xì)菌生物被膜的結(jié)構(gòu)特征14-17
• 1.1.2 細(xì)菌生物被膜的生長周期17-19
• 1.2 氣液生物被膜中的金屬離子19-20
• 1.3 S. oneidensis的末端氧化酶及其調(diào)控系統(tǒng)20-26
• 1.3.1 細(xì)胞色素氧化酶概述21
• 1.3.2 細(xì)菌中的末端氧化酶21-25
• 1.3.3 S. oneidensis的末端氧化酶25-26
• 1.4 本研究的背景、主要內(nèi)容及意義26-29
• 2 二價(jià)金屬陽離子對S. oneidensis氣液生物被膜的影響29-56
• 2.1 材料與方法29-35
• 2.1.1 化學(xué)藥品和試劑29-31
• 2.1.2 供試菌株、質(zhì)粒以及培養(yǎng)條件31-32
• 2.1.3 框內(nèi)缺失突變株的構(gòu)建與回補(bǔ)32-33
• 2.1.4 氣液生物被膜的培養(yǎng)及生物量的測定33
• 2.1.5 β-半乳糖苷酶活性檢測33-34
• 2.1.6 通過Ferrozine試驗(yàn)測定鐵的氧化物中Fe~(2+)和Fe~(3+)的比例34-35
• 2.2 結(jié)果與分析35-51
• 2.2.1 S. oneidensis氣液生物被膜的形成需要二價(jià)金屬陽離子35-39
• 2.2.2 Mg~(2+)和Fe~(2+)對于氣液生物被膜的形成是必要的39-43
• 2.2.3 Fe~(2+)的氧化對氣液生物被膜形成的影響43-46
• 2.2.4 不可溶電子受體能夠破壞S. oneidensis的氣液生物被膜46-50
• 2.2.5 鐵離子對△cymA和△crp的氣液生物被膜沒有影響50-51
• 2.3 討論51-56
• 2.3.1 Fe~(2+)對S. oneidensis氣液生物被膜的影響52-53
• 2.3.2 鐵氧化合物的形成能夠破壞S. oneidensis氣液生物被膜53-54
• 2.3.3 S. oneidensis傾向于在不可溶電子受體表面形成固體生物被膜54-56
• 3 c型細(xì)胞色素在有氧呼吸中起到關(guān)鍵作用56-72
• 3.1 材料與方法56-61
• 3.1.1 供試菌株、質(zhì)粒以及培養(yǎng)條件56-57
• 3.1.2 框內(nèi)缺失突變株的構(gòu)建與回補(bǔ)57-58
• 3.1.3 S. oneidensis有氧培養(yǎng)及生長速率測定58
• 3.1.4 Nadi試驗(yàn)58-59
• 3.1.5 生理特性研究59
• 3.1.6 存活率試驗(yàn)59
• 3.1.7 啟動(dòng)子活性檢測59-60
• 3.1.8 qRT-PCR60-61
• 3.2 結(jié)果與分析61-69
• 3.2.1 細(xì)胞色素c蛋白在有氧生長中的重要作用61-63
• 3.2.2 細(xì)胞色素cbb_3氧化酶在S. oneidensis的有氧呼吸中至關(guān)重要63-65
• 3.2.3 細(xì)胞色素cbb_3氧化酶和細(xì)胞色素bd氧化酶在微氧呼吸中起到關(guān)鍵作用65-66
• 3.2.4 S. oneidensis末端氧化酶在呼吸中的功能與表達(dá)水平有關(guān)66-68
• 3.2.5 cyd操縱子的補(bǔ)償表達(dá)68-69
• 3.3 討論69-72
• 3.3.1 S. oneidensis在有氧條件下主要利用cbb_3型氧化酶進(jìn)行呼吸69-70
• 3.3.2 S. oneidensis中細(xì)胞色素caa_3氧化酶功能喪失70-72
• 4 S. oneidensis呼吸系統(tǒng)的調(diào)控72-81
• 4.1 材料與方法72-74
• 4.1.1 供試菌株、質(zhì)粒以及培養(yǎng)條件72-73
• 4.1.2 啟動(dòng)子活性檢測73
• 4.1.3 Crp-His融合蛋白的表達(dá)純化73-74
• 4.1.4 EMSA試驗(yàn)74
• 4.2 結(jié)果與分析74-78
• 4.2.1 全局調(diào)控因子ArcA,Crp和Fnr對cco,cox以及cyd操縱子表達(dá)的影響74-76
• 4.2.2 Crp蛋白的DNA結(jié)合特征76-78
• 4.3 討論78-81
• 5 論文總結(jié)81-85
• 5.1 主要研究結(jié)論81-83
• 5.2 創(chuàng)新之處83
• 5.3 不足及展望83-85
• 參考文獻(xiàn)85-98
• 附錄98-101
• 致謝101-103
• 作者簡介103-104

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