本文關(guān)鍵詞：苜蓿中華根瘤菌PrkA蛋白激酶活性的驗(yàn)證及其磷酸蛋白組學(xué)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：苜蓿中華根瘤菌能夠通過調(diào)控其細(xì)胞活動(dòng)來應(yīng)對(duì)土壤環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)脅迫和多種逆境壓力,并有效的同豆科植物苜蓿之間建立共生互作關(guān)系。原核生物中分布非常廣泛的PrkA蛋白激酶在多種逆境條件下在生長(zhǎng)的穩(wěn)定期能夠被大量誘導(dǎo)表達(dá),但是到目前為止,還沒有找到prkA缺失突變體的顯著表型。鑒于PrkA蛋白是一個(gè)潛在的原核生物絲氨酸蛋白激酶,本研究對(duì)苜蓿中華根瘤菌的PrkA蛋白序列進(jìn)行克隆,過表達(dá)和純化。利用PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到了PrkA的蛋白表達(dá)序列,將克隆得到的蛋白表達(dá)序列插入蛋白表達(dá)載體pET-28a (+)中,受噬菌體T7啟動(dòng)子和lac操縱子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,然后直接轉(zhuǎn)化到E. coli BL21 (DE3)菌株中,經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)到了一個(gè)大小約75 kDa的蛋白,這同PrkA預(yù)測(cè)到的大小值74.2 kDa比較接近。同時(shí),還純化了缺失AAAdomain的PrkA蛋白,并且在體外條件下,對(duì)PrkA以及ΔAAA_PrkA蛋白的自我磷酸化以及對(duì)酪蛋白的底物磷酸化活性進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明,二價(jià)陽(yáng)離子對(duì)其激酶活性呈現(xiàn)了不同的誘導(dǎo)作用,其中,Mn2+促進(jìn)PrkA的激酶活性,并且在2 mM濃度下催化活性達(dá)到最大,而Mg2+對(duì)其催化活性有一定的抑制作用。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)AAA domain對(duì)其催化活性是必需的。為了進(jìn)一步了解Sinorhizobium meliloti和PrkA蛋白激酶相關(guān)的磷酸蛋白圖譜,利用Ti02富集手段結(jié)合LC-MS/MS技術(shù)分析了穩(wěn)定期(OD600=1.886)在12mMP(基本培養(yǎng)基含有12 mM無機(jī)磷)培養(yǎng)條件下Sinorhizobium meliloti CCBAU01290 WT和ΔprkA突變體的磷酸蛋白組圖譜,在這個(gè)條件下一共檢測(cè)到了154個(gè)特異性磷酸化位點(diǎn)(Ser:Thr:Tyr=97:51:6),相應(yīng)的磷酸化肽段為142個(gè),一共檢測(cè)到了123個(gè)磷酸化蛋白。其中WT和ΔprkA突變體特異性磷酸蛋白分別為45和40,還有38個(gè)磷酸化蛋白是兩者共有的,但是這些蛋白的磷酸化位點(diǎn)并不都是保守的。檢測(cè)到的磷酸化蛋白廣泛地分布于多種生物學(xué)過程,細(xì)胞功能,細(xì)胞組分以及分子功能。通過分析WT和ΔprkA突變體磷酸蛋白組學(xué)研究鑒定到的差異化信號(hào)有可能幫助了解和PrkA激酶相關(guān)的磷酸化事件。Sinorhizobium meliloti CCBAU01290 WT和AprkA突變體在2mMP (OD600=0.889)條件下,發(fā)現(xiàn)兩者的混合競(jìng)爭(zhēng)能力存在顯著性的差異,為此我們還進(jìn)一步分析了2mMP條件下的WT和ΔprkA突變體的磷酸蛋白圖譜,分別檢測(cè)到了8個(gè)(ΔprkA突變體)和12個(gè)(WT)磷酸化蛋白信號(hào)。這是我們第一次利用磷酸蛋白組學(xué)技術(shù)分析S. meliloti的磷酸蛋白組圖譜,并對(duì)不同條件下檢測(cè)到的磷酸化蛋白以及磷酸化位點(diǎn)的差異信號(hào)進(jìn)行了討論。
【關(guān)鍵詞】：PrkA 蛋白磷酸化 脅迫反應(yīng) 苜蓿中華根瘤菌 磷酸蛋白組學(xué)
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q939.114
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 縮略詞一覽表10-12
• 第一章 緒論12-39
• 1.1 引言12-13
• 1.2 根瘤菌和豆科植物高效共生固氮體系的建立13-16
• 1.3 豆科植物和根瘤菌分子對(duì)話機(jī)制的研究概況16-18
• 1.4 根瘤菌和豆科植物在根圈的互作以及根圈微生物適應(yīng)環(huán)境的機(jī)制18-27
• 1.5 蛋白磷酸化在研究細(xì)菌抗逆機(jī)制中的研究概況27-31
• 1.6 磷酸蛋白組學(xué)技術(shù)在研究細(xì)菌抗逆機(jī)制中的進(jìn)展31-36
• 1.7 本研究的目的和意義36-39
• 第二章 材料與方法39-64
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料39-42
• 2.1.1 菌株和載體39
• 2.1.2 培養(yǎng)基39-40
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑40-42
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法42-64
• 2.2.1 根瘤菌的分離純化和保存42
• 2.2.2 表型分析實(shí)驗(yàn)42
• 2.2.3 磷含量的檢測(cè)42-43
• 2.2.4 PrkA以及△AAA_PrkA蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建,表達(dá)和純化43-49
• 2.2.5 SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)以及BCA法檢測(cè)蛋白的濃度49-50
• 2.2.6 PrkA和△AAA_PrkA蛋白的體外磷酸化50-51
• 2.2.7 親和層析尋找蛋白激酶PrkA潛在的靶蛋白51-53
• 2.2.8 Sinorhizobium meliloti CCBAU01290基因組測(cè)序,組裝和注釋53-58
• 2.2.9 Sinorhizobium meliloti CCBAU01290的磷酸蛋白組學(xué)研究58-62
• 2.2.10 Sinorhizobium meliloti CCBAU01290的磷酸蛋白組學(xué)研究的數(shù)據(jù)處理和生物信息學(xué)分析62-64
• 第三章 Sinorhizobium meliloti CCBAU01290 PrkA蛋白激酶活性的驗(yàn)證64-77
• 3.1 引言64-67
• 3.2 結(jié)果與分析67-75
• 3.2.1 Sinorhizobium meliloti CCBAU01290 WT和△prkA突變體在逆境脅迫條件下的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)67-69
• 3.2.2 磷含量的檢測(cè)結(jié)果69-71
• 3.2.3 PrkA以及△AAA PrkA蛋白的表達(dá)和純化71-73
• 3.2.4 PrkA以及△AAA PrkA蛋白的體外磷酸化實(shí)驗(yàn)結(jié)果73-75
• 3.3 結(jié)論75-77
• 第四章 Sinorhizobium meliloti CCBAU01290的磷酸蛋白組學(xué)研究77-109
• 4.1 引言77
• 4.2 結(jié)論與分析77-107
• 4.2.1 Sinorhizobium meliloti CCBAU01290基因組DNA樣品的準(zhǔn)備和確認(rèn)77-78
• 4.2.2 Sinorhizobium meliloti CCBAU01290基因組的組裝和注釋78-80
• 4.2.3 Sinorhizobium meliloti CCBAU01290磷酸蛋白組學(xué)研究的蛋白樣品的準(zhǔn)備和驗(yàn)證80-81
• 4.2.4 Sinorhizobium meliloti CCBAU01290磷酸蛋白組學(xué)研究的數(shù)據(jù)處理和生物信息學(xué)分析81-107
• 4.3 結(jié)論107-109
• 第五章 結(jié)論與展望109-112
• 5.1 結(jié)論109
• 5.2 展望109-112
• 參考文獻(xiàn)112-133
• 附錄133-147
• 致謝147-148
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷148

  本文關(guān)鍵詞：苜蓿中華根瘤菌PrkA蛋白激酶活性的驗(yàn)證及其磷酸蛋白組學(xué)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：254481