【摘要】：氮的再分配是植物提高氮利用效率的關(guān)鍵步驟之一。不同器官之間的氮轉(zhuǎn)運主要由硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運蛋白(Nitrate Transporter,NRT)負責完成,但是目前對于NRT蛋白的調(diào)控機制知之甚少。擬南芥E3泛素化連接酶NLA(Nitrate Limitation Adapation)RING功能域缺失突變株nla無法適應(yīng)3 mM硝酸鉀低氮脅迫。有結(jié)果表明,nla缺氮適應(yīng)性反應(yīng)缺失是由于低氮脅迫下磷中毒造成的,而對于NLA與氮的作用關(guān)系以及NLA在植物適應(yīng)低氮脅迫中的作用機制并無闡述。因此本研究通過水培、氮含量測定、氮同位素示蹤等實驗方法找到突變株nla與野生型表型差異的原因,并通過生理生化、分子生物學等相關(guān)手段找到NLA可能作用的靶蛋白并進行驗證,闡述NLA在植物適應(yīng)低氮脅迫中的作用機制。主要實驗結(jié)果和結(jié)論如下:1正常氮供應(yīng)條件下,野生型與突變株nla之間生長狀況并無顯著差異,但在低氮處理3天后,95%nla突變株老葉失綠、枯黃,而只有10%野生型出現(xiàn)了與突變株nla相似的表型。2與正常氮供應(yīng)相比,缺氮3天后野生型與突變株nla體內(nèi)的氮含量都明顯下降。野生型1-4位老葉和其余葉片中的氮含量分別下降了15.5%和24.3%,而突變株nla老葉中氮含量的下降明顯高于野生型,新葉中氮含量下降值則小于野生型。該實驗暗示NLA可能參與擬南芥體內(nèi)氮由老葉向新葉的再分配過程。3為了進一步證實2中的結(jié)論,我們對野生型及突變株nla進行了15N同位素示蹤和吸收實驗。將15N涂抹老葉24 h后測定發(fā)現(xiàn),nla新葉中15N含量達到了11%,約是野生型新葉中15N含量的兩倍。15N吸收實驗則發(fā)現(xiàn),nla突變株新葉中15N/老葉中15N達到了7.57,而野生型僅為4.08。4 NRT1.7主要負責老葉中硝態(tài)氮向新葉中的再分配。利用Ubpred在線軟件分析表明,NRT1.7蛋白含有多個泛素化位點,其中21位、34位、606位處的賴氨酸得分最高,前兩個位點集中在NRT1.7蛋白的N-端,606位賴氨酸則位于NRT1.7跨膜結(jié)構(gòu)域的loop區(qū)。5共轉(zhuǎn)pPR3-NLASPX及pBT3-NRT1.7質(zhì)粒的酵母菌NMY51能夠在SD-His-Ade-Trp-Leu培養(yǎng)基上正常生長,并且在加入His和X-gal后能激活β-半乳糖苷酶活性進而分解X-gal,顯現(xiàn)藍斑;將攜帶nYFP-NLA和cYFP-NRT1.7兩種質(zhì)粒的農(nóng)桿菌共注射煙草,在細胞質(zhì)膜上觀察到了黃色YFP熒光信號;GST-NLA融合蛋白的Pull-down實驗中則檢測到了Myc-NRT1.7蛋白;Co-IP實驗洗脫液中檢測到了與Myc-NRT1.7相互作用的NLA蛋白。酵母雙雜、BiFC、Co-IP、Pull-down等均實驗證實了NLA和NRT1.7之間存在相互作用。6 Western blot實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),與過表達植株35S::Myc-NRT1.7相比,35S::NLA/35S::Myc-NRT1.7雙雜植株中NRT1.7蛋白豐度顯著降低。與野生型相比,突變株nla中NRT1.7蛋白表達豐度顯著升高。NLA與NRT1.7的體外泛素化實驗則證實完整的NLA能夠降解NRT1.7。7 Northern blot、熒光定量分析及Western blot結(jié)果顯示,對野生型進行低氮處理后,miR827的表達量增加,其靶基因NLA轉(zhuǎn)錄本無顯著下調(diào),但蛋白表達豐度隨缺氮時間的延長而顯著下降;對野生型,miR827加工路徑突變株rdr2、dcl3以及mir827敲除突變株進行低氮處理,熒光定量分析發(fā)現(xiàn)NLA轉(zhuǎn)錄本均無明顯變化;與野生型低氮處理不同,這些突變株中NLA蛋白豐度不隨缺氮時間的延長而下調(diào)。上述實驗表明NLA翻譯水平的抑制依賴于miR827。8 mir827敲除突變株、miR827加工路徑突變株rdr2、dcl3的NLA轉(zhuǎn)錄本無明顯變化,蛋白卻有明顯積累;35S::MIR827純合系中NLA的轉(zhuǎn)錄水平無明顯下調(diào),蛋白表達量下降。這些實驗均表明miR827對NLA的調(diào)控發(fā)生在翻譯水平。因此,我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA對于靶基因在翻譯水平的調(diào)控與泛素化在蛋白后修飾調(diào)控共同參與植物適應(yīng)缺氮脅迫的反應(yīng)機制。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2

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本文編號：2467546