發(fā)布時(shí)間：2019-04-28 10:11

【摘要】：氮的再分配是植物提高氮利用效率的關(guān)鍵步驟之一。不同器官之間的氮轉(zhuǎn)運(yùn)主要由硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Nitrate Transporter,NRT)負(fù)責(zé)完成,但是目前對(duì)于NRT蛋白的調(diào)控機(jī)制知之甚少。擬南芥E3泛素化連接酶NLA(Nitrate Limitation Adapation)RING功能域缺失突變株nla無(wú)法適應(yīng)3 mM硝酸鉀低氮脅迫。有結(jié)果表明,nla缺氮適應(yīng)性反應(yīng)缺失是由于低氮脅迫下磷中毒造成的,而對(duì)于NLA與氮的作用關(guān)系以及NLA在植物適應(yīng)低氮脅迫中的作用機(jī)制并無(wú)闡述。因此本研究通過(guò)水培、氮含量測(cè)定、氮同位素示蹤等實(shí)驗(yàn)方法找到突變株nla與野生型表型差異的原因,并通過(guò)生理生化、分子生物學(xué)等相關(guān)手段找到NLA可能作用的靶蛋白并進(jìn)行驗(yàn)證,闡述NLA在植物適應(yīng)低氮脅迫中的作用機(jī)制。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果和結(jié)論如下:1正常氮供應(yīng)條件下,野生型與突變株nla之間生長(zhǎng)狀況并無(wú)顯著差異,但在低氮處理3天后,95%nla突變株老葉失綠、枯黃,而只有10%野生型出現(xiàn)了與突變株nla相似的表型。2與正常氮供應(yīng)相比,缺氮3天后野生型與突變株nla體內(nèi)的氮含量都明顯下降。野生型1-4位老葉和其余葉片中的氮含量分別下降了15.5%和24.3%,而突變株nla老葉中氮含量的下降明顯高于野生型,新葉中氮含量下降值則小于野生型。該實(shí)驗(yàn)暗示NLA可能參與擬南芥體內(nèi)氮由老葉向新葉的再分配過(guò)程。3為了進(jìn)一步證實(shí)2中的結(jié)論,我們對(duì)野生型及突變株nla進(jìn)行了15N同位素示蹤和吸收實(shí)驗(yàn)。將15N涂抹老葉24 h后測(cè)定發(fā)現(xiàn),nla新葉中15N含量達(dá)到了11%,約是野生型新葉中15N含量的兩倍。15N吸收實(shí)驗(yàn)則發(fā)現(xiàn),nla突變株新葉中15N/老葉中15N達(dá)到了7.57,而野生型僅為4.08。4 NRT1.7主要負(fù)責(zé)老葉中硝態(tài)氮向新葉中的再分配。利用Ubpred在線(xiàn)軟件分析表明,NRT1.7蛋白含有多個(gè)泛素化位點(diǎn),其中21位、34位、606位處的賴(lài)氨酸得分最高,前兩個(gè)位點(diǎn)集中在NRT1.7蛋白的N-端,606位賴(lài)氨酸則位于NRT1.7跨膜結(jié)構(gòu)域的loop區(qū)。5共轉(zhuǎn)pPR3-NLASPX及pBT3-NRT1.7質(zhì)粒的酵母菌NMY51能夠在SD-His-Ade-Trp-Leu培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng),并且在加入His和X-gal后能激活β-半乳糖苷酶活性進(jìn)而分解X-gal,顯現(xiàn)藍(lán)斑;將攜帶nYFP-NLA和cYFP-NRT1.7兩種質(zhì)粒的農(nóng)桿菌共注射煙草,在細(xì)胞質(zhì)膜上觀察到了黃色YFP熒光信號(hào);GST-NLA融合蛋白的Pull-down實(shí)驗(yàn)中則檢測(cè)到了Myc-NRT1.7蛋白;Co-IP實(shí)驗(yàn)洗脫液中檢測(cè)到了與Myc-NRT1.7相互作用的NLA蛋白。酵母雙雜、BiFC、Co-IP、Pull-down等均實(shí)驗(yàn)證實(shí)了NLA和NRT1.7之間存在相互作用。6 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與過(guò)表達(dá)植株35S::Myc-NRT1.7相比,35S::NLA/35S::Myc-NRT1.7雙雜植株中NRT1.7蛋白豐度顯著降低。與野生型相比,突變株nla中NRT1.7蛋白表達(dá)豐度顯著升高。NLA與NRT1.7的體外泛素化實(shí)驗(yàn)則證實(shí)完整的NLA能夠降解NRT1.7。7 Northern blot、熒光定量分析及Western blot結(jié)果顯示,對(duì)野生型進(jìn)行低氮處理后,miR827的表達(dá)量增加,其靶基因NLA轉(zhuǎn)錄本無(wú)顯著下調(diào),但蛋白表達(dá)豐度隨缺氮時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著下降;對(duì)野生型,miR827加工路徑突變株rdr2、dcl3以及mir827敲除突變株進(jìn)行低氮處理,熒光定量分析發(fā)現(xiàn)NLA轉(zhuǎn)錄本均無(wú)明顯變化;與野生型低氮處理不同,這些突變株中NLA蛋白豐度不隨缺氮時(shí)間的延長(zhǎng)而下調(diào)。上述實(shí)驗(yàn)表明NLA翻譯水平的抑制依賴(lài)于miR827。8 mir827敲除突變株、miR827加工路徑突變株rdr2、dcl3的NLA轉(zhuǎn)錄本無(wú)明顯變化,蛋白卻有明顯積累;35S::MIR827純合系中NLA的轉(zhuǎn)錄水平無(wú)明顯下調(diào),蛋白表達(dá)量下降。這些實(shí)驗(yàn)均表明miR827對(duì)NLA的調(diào)控發(fā)生在翻譯水平。因此,我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA對(duì)于靶基因在翻譯水平的調(diào)控與泛素化在蛋白后修飾調(diào)控共同參與植物適應(yīng)缺氮脅迫的反應(yīng)機(jī)制。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：Q943.2

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本文編號(hào)：2467546