【摘要】：臍帶間充質(zhì)干細胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs)來源于新生兒出生后廢棄的臍帶組織,具有強大的自我更新能力和向脂肪細胞、骨細胞、神經(jīng)細胞、肝細胞及肌細胞分化潛能。因其來源豐富,易于獲取,且獲取無創(chuàng)傷加之免疫原性低下,增殖能力強,無倫理性爭議等優(yōu)勢,成為組織修復和器官重建理想的種子細胞來源,廣泛應用于再生醫(yī)學當中。臨床研究中發(fā)現(xiàn):間充質(zhì)干細胞移植治療組織損傷時,單次移植細胞數(shù)量高達到1×109個才能有效發(fā)揮治療作用。另外干細胞再生醫(yī)學研究中,為了保持實驗結(jié)果的穩(wěn)定性和可比性,需要大量的均一來源的種子細胞。因此如何高效規(guī)模化擴增具有原代生物學特征的間充質(zhì)干細胞,成為干細胞再生醫(yī)學研究和應用的基礎和關(guān)鍵。本實驗首先利用微載體結(jié)合生物反應器,建立了三維立體培養(yǎng)、規(guī)�；瘮U增人臍帶間充質(zhì)干細胞的專利技術(shù)。該技術(shù)操作簡單,效率高,短時間內(nèi)擴增的種子細胞高達109以上,避免了因細胞反復傳代而導致的間充質(zhì)干細胞老化、甚至惡變。細胞生物學、分子生物學和生物化學檢測發(fā)現(xiàn):三維立體培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細胞具有與平面培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細胞相同干細胞表面標志物的表達水平和增殖能力以及成脂肪、成骨及成軟骨分化潛能。動物實驗研究表明:三維立體培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞具有與平面培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞相類似的促進皮膚創(chuàng)傷愈合的能力。在干細胞移植修復小鼠皮膚損傷實驗中,我們將人臍帶間充質(zhì)干細胞移植到正常小鼠的皮膚創(chuàng)面上。由于異種移植存在強烈的免疫反應,因此移植到小鼠皮膚創(chuàng)面上的人臍帶間充質(zhì)干細胞將會被小鼠自身的免疫反應排斥掉。但與對照組比較,移植人臍帶間充質(zhì)干細胞小鼠皮膚創(chuàng)面愈合率顯著好于對照組,推測人臍帶間充質(zhì)干細胞可能通過旁分泌作用促進創(chuàng)面愈合。于是我們開展了人臍帶間充質(zhì)干細胞修復皮膚創(chuàng)傷的分子機制研究。外泌體(Exosomes,Ex)是細胞通過出芽方式而分泌的納米級細胞膜包裹的囊性小泡,含有豐富的m RNA,micro RNA及蛋白質(zhì)等成分。外泌體通過與靶細胞融合,將其中的內(nèi)含物m RNA,micro RNA和蛋白質(zhì)等成分注入到靶細胞中,調(diào)控靶細胞的增殖、遷移、凋亡。本實驗首先采用超高速離心法從臍帶間充質(zhì)干細胞的條件培養(yǎng)基中分離出外泌體。透射電鏡檢測顯示該外泌體直徑約為40-100nm,呈圓形或卵圓形。Western blot顯示該外泌體表達表面標志蛋白CD9及CD63。至此我們成功地獲得了人臍帶間充質(zhì)干細胞源的外泌體(human unbilical cord mesenchymal stem cell exosomes,huc MSC-Ex)。為了檢測外泌體是否通過改變表皮細胞的生物學行為促進皮膚創(chuàng)傷愈合。我們利用1m M過氧化氫(H_2O_2)誘導永生化角朊細胞(Ha Ca T)凋亡,建立了皮膚損傷細胞模型。細胞生物學行為檢測發(fā)現(xiàn)huc MSC-Ex顯著促進Ha Ca T增殖,呈時間-劑量效應關(guān)系,同時可以促進Ha Ca T的遷移,抑制H_2O_2誘導的Ha Ca T細胞凋亡。我們利用PKH26標記huc MSC-Ex后與Ha Ca T共培養(yǎng),結(jié)果顯示huc MSC-Ex可以進入Ha Ca T細胞漿中,可能發(fā)揮細胞交流的作用。為進一步探究huc MSC-Ex抑制H_2O_2誘導的Ha Ca T細胞凋亡的機制,我們首先對H_2O_2誘導Ha Ca T細胞凋亡的分子機制進行了探討。Tunnel染色以及Annexin V-PI雙染和流式細胞技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn):加入H_2O_2后,Ha Ca T細胞凋亡明顯增加,同時伴有凋亡誘導因子(Apoptosis inducing AIF)轉(zhuǎn)位入核率增加。Western blot顯示,加入H_2O_2后,Ha Ca T細胞線粒體中AIF、細胞色素C(Cytochrome c)表達顯著下調(diào),鈣蛋白酶1(Calpain1)表達顯著上調(diào);細胞漿中細胞色素C、Caspase3表達顯著上調(diào),熱休克蛋白70(Hsp70)表達明顯下調(diào);細胞核中多聚ADP聚合酶1(Poly(ADP-ribose)polymerase 1,PARP-1)表達、聚ADP核糖(Poly-(ADP)ribose,PAR)和親環(huán)素A(cyclosporine A,Cy PA)表達顯著上調(diào)。加入PARP-1抑制劑DPQ后,Ha Ca T細胞核內(nèi)AIF和PAR表達下調(diào),AIF轉(zhuǎn)位入核率下降,細胞凋亡率明顯下降。相反加入Caspas3抑制劑Ac-DEVD-CHO后,Ha Ca T細胞凋亡率沒有顯著下降。據(jù)此我們得出結(jié)論:H_2O_2通過Caspase非依賴線粒體凋亡信號通路,即AIF-PARP信號通路誘導Ha Ca T細胞凋亡。我們在Ha Ca T細胞凋亡模型中加入MSC同化培養(yǎng)基(huc MSC-CM)、huc MSC-Ex和去除外泌體的同化培養(yǎng)基(huc MSC-dp-Ex)。免疫熒光染色顯示:與加入huc MSC-dp-Ex比加入huc MSC-CM或huc MSC-Ex顯著降低Ha Ca T細胞凋亡數(shù)量和AIF轉(zhuǎn)位入核數(shù)量。與免疫熒光染色相類似,加入huc MSC-CM或huc MSC-Ex顯著下調(diào)降低PARP-1和PAR表達。至此我們得出如下結(jié)論:huc MSC-Ex通過AIF轉(zhuǎn)位入核,下調(diào)PARP-1和PAR表達,通過Caspase非依賴的線粒體凋亡途徑,抑制H_2O_2誘導的Ha Ca T凋亡。綜上所述,我們通過建立微載體-生物反應器三維培養(yǎng)技術(shù),高效規(guī)模化擴增了人臍帶間充質(zhì)干細胞。經(jīng)過該技術(shù)擴增的間充質(zhì)干細胞仍保留間充質(zhì)干細胞表面標志物以及成脂、成骨和成軟骨分化的多向分化潛能。移植人臍帶間充質(zhì)干細胞可以促進小鼠背部皮膚創(chuàng)面愈合。此項技術(shù)的建立為干細胞生物學和再生醫(yī)學研究和應用提供了充足的具有可比性的種子細胞來源。我們利用超高速梯度離心技術(shù),從人臍帶間充質(zhì)干細胞的條件培養(yǎng)液中收獲了外泌體。進一步研究發(fā)現(xiàn)人臍帶間充質(zhì)干細胞來源的外泌體可以促進Ha Ca T細胞的增殖及遷移,抑制Caspase非依賴的線粒體凋亡信號通路,即AIF-PARP信號通路促進皮膚創(chuàng)面的修復,在皮膚創(chuàng)傷修復機制上形成了新的突破。外泌體來源豐富,易于獲取,便于儲存,移植后不誘發(fā)免疫排斥反應,有望成為重要的生物創(chuàng)新藥。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R329.2

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