【摘要】：臍帶間充質干細胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs)來源于新生兒出生后廢棄的臍帶組織,具有強大的自我更新能力和向脂肪細胞、骨細胞、神經細胞、肝細胞及肌細胞分化潛能。因其來源豐富,易于獲取,且獲取無創(chuàng)傷加之免疫原性低下,增殖能力強,無倫理性爭議等優(yōu)勢,成為組織修復和器官重建理想的種子細胞來源,廣泛應用于再生醫(yī)學當中。臨床研究中發(fā)現(xiàn):間充質干細胞移植治療組織損傷時,單次移植細胞數(shù)量高達到1×109個才能有效發(fā)揮治療作用。另外干細胞再生醫(yī)學研究中,為了保持實驗結果的穩(wěn)定性和可比性,需要大量的均一來源的種子細胞。因此如何高效規(guī)�；瘮U增具有原代生物學特征的間充質干細胞,成為干細胞再生醫(yī)學研究和應用的基礎和關鍵。本實驗首先利用微載體結合生物反應器,建立了三維立體培養(yǎng)、規(guī)模化擴增人臍帶間充質干細胞的專利技術。該技術操作簡單,效率高,短時間內擴增的種子細胞高達109以上,避免了因細胞反復傳代而導致的間充質干細胞老化、甚至惡變。細胞生物學、分子生物學和生物化學檢測發(fā)現(xiàn):三維立體培養(yǎng)的臍帶間充質干細胞具有與平面培養(yǎng)的臍帶間充質干細胞相同干細胞表面標志物的表達水平和增殖能力以及成脂肪、成骨及成軟骨分化潛能。動物實驗研究表明:三維立體培養(yǎng)的間充質干細胞具有與平面培養(yǎng)的間充質干細胞相類似的促進皮膚創(chuàng)傷愈合的能力。在干細胞移植修復小鼠皮膚損傷實驗中,我們將人臍帶間充質干細胞移植到正常小鼠的皮膚創(chuàng)面上。由于異種移植存在強烈的免疫反應,因此移植到小鼠皮膚創(chuàng)面上的人臍帶間充質干細胞將會被小鼠自身的免疫反應排斥掉。但與對照組比較,移植人臍帶間充質干細胞小鼠皮膚創(chuàng)面愈合率顯著好于對照組,推測人臍帶間充質干細胞可能通過旁分泌作用促進創(chuàng)面愈合。于是我們開展了人臍帶間充質干細胞修復皮膚創(chuàng)傷的分子機制研究。外泌體(Exosomes,Ex)是細胞通過出芽方式而分泌的納米級細胞膜包裹的囊性小泡,含有豐富的m RNA,micro RNA及蛋白質等成分。外泌體通過與靶細胞融合,將其中的內含物m RNA,micro RNA和蛋白質等成分注入到靶細胞中,調控靶細胞的增殖、遷移、凋亡。本實驗首先采用超高速離心法從臍帶間充質干細胞的條件培養(yǎng)基中分離出外泌體。透射電鏡檢測顯示該外泌體直徑約為40-100nm,呈圓形或卵圓形。Western blot顯示該外泌體表達表面標志蛋白CD9及CD63。至此我們成功地獲得了人臍帶間充質干細胞源的外泌體(human unbilical cord mesenchymal stem cell exosomes,huc MSC-Ex)。為了檢測外泌體是否通過改變表皮細胞的生物學行為促進皮膚創(chuàng)傷愈合。我們利用1m M過氧化氫(H_2O_2)誘導永生化角朊細胞(Ha Ca T)凋亡,建立了皮膚損傷細胞模型。細胞生物學行為檢測發(fā)現(xiàn)huc MSC-Ex顯著促進Ha Ca T增殖,呈時間-劑量效應關系,同時可以促進Ha Ca T的遷移,抑制H_2O_2誘導的Ha Ca T細胞凋亡。我們利用PKH26標記huc MSC-Ex后與Ha Ca T共培養(yǎng),結果顯示huc MSC-Ex可以進入Ha Ca T細胞漿中,可能發(fā)揮細胞交流的作用。為進一步探究huc MSC-Ex抑制H_2O_2誘導的Ha Ca T細胞凋亡的機制,我們首先對H_2O_2誘導Ha Ca T細胞凋亡的分子機制進行了探討。Tunnel染色以及Annexin V-PI雙染和流式細胞技術檢測發(fā)現(xiàn):加入H_2O_2后,Ha Ca T細胞凋亡明顯增加,同時伴有凋亡誘導因子(Apoptosis inducing AIF)轉位入核率增加。Western blot顯示,加入H_2O_2后,Ha Ca T細胞線粒體中AIF、細胞色素C(Cytochrome c)表達顯著下調,鈣蛋白酶1(Calpain1)表達顯著上調;細胞漿中細胞色素C、Caspase3表達顯著上調,熱休克蛋白70(Hsp70)表達明顯下調;細胞核中多聚ADP聚合酶1(Poly(ADP-ribose)polymerase 1,PARP-1)表達、聚ADP核糖(Poly-(ADP)ribose,PAR)和親環(huán)素A(cyclosporine A,Cy PA)表達顯著上調。加入PARP-1抑制劑DPQ后,Ha Ca T細胞核內AIF和PAR表達下調,AIF轉位入核率下降,細胞凋亡率明顯下降。相反加入Caspas3抑制劑Ac-DEVD-CHO后,Ha Ca T細胞凋亡率沒有顯著下降。據(jù)此我們得出結論:H_2O_2通過Caspase非依賴線粒體凋亡信號通路,即AIF-PARP信號通路誘導Ha Ca T細胞凋亡。我們在Ha Ca T細胞凋亡模型中加入MSC同化培養(yǎng)基(huc MSC-CM)、huc MSC-Ex和去除外泌體的同化培養(yǎng)基(huc MSC-dp-Ex)。免疫熒光染色顯示:與加入huc MSC-dp-Ex比加入huc MSC-CM或huc MSC-Ex顯著降低Ha Ca T細胞凋亡數(shù)量和AIF轉位入核數(shù)量。與免疫熒光染色相類似,加入huc MSC-CM或huc MSC-Ex顯著下調降低PARP-1和PAR表達。至此我們得出如下結論:huc MSC-Ex通過AIF轉位入核,下調PARP-1和PAR表達,通過Caspase非依賴的線粒體凋亡途徑,抑制H_2O_2誘導的Ha Ca T凋亡。綜上所述,我們通過建立微載體-生物反應器三維培養(yǎng)技術,高效規(guī)�；瘮U增了人臍帶間充質干細胞。經過該技術擴增的間充質干細胞仍保留間充質干細胞表面標志物以及成脂、成骨和成軟骨分化的多向分化潛能。移植人臍帶間充質干細胞可以促進小鼠背部皮膚創(chuàng)面愈合。此項技術的建立為干細胞生物學和再生醫(yī)學研究和應用提供了充足的具有可比性的種子細胞來源。我們利用超高速梯度離心技術,從人臍帶間充質干細胞的條件培養(yǎng)液中收獲了外泌體。進一步研究發(fā)現(xiàn)人臍帶間充質干細胞來源的外泌體可以促進Ha Ca T細胞的增殖及遷移,抑制Caspase非依賴的線粒體凋亡信號通路,即AIF-PARP信號通路促進皮膚創(chuàng)面的修復,在皮膚創(chuàng)傷修復機制上形成了新的突破。外泌體來源豐富,易于獲取,便于儲存,移植后不誘發(fā)免疫排斥反應,有望成為重要的生物創(chuàng)新藥。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R329.2

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