【摘要】：生物活性肽可作為高效、安全的生物制品,具有重要的研究價(jià)值和應(yīng)用前景。鴨肫屬優(yōu)質(zhì)蛋白資源,高值化開發(fā)利用是產(chǎn)業(yè)發(fā)展的方向。本論文以鴨肫蛋白為原料,通過可控酶解技術(shù)制備抗氧化肽;利用超濾、凝膠過濾色譜、反相高效液相色譜對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行逐級(jí)分離純化,采用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)目標(biāo)肽段進(jìn)行一級(jí)氨基酸序列的鑒定;建立分子結(jié)構(gòu)模型并驗(yàn)證抗氧化肽的定量構(gòu)效關(guān)系;通過作用于細(xì)胞,分析細(xì)胞生長抑制、凋亡、生長周期以及細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性及酶蛋白表達(dá),從分子機(jī)制進(jìn)一步闡明鴨肫肽的抗氧化機(jī)理。本文旨為鴨肫蛋白的深度開發(fā)和應(yīng)用,提升其資源高值化利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。本論文的主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:(1)分析了木瓜蛋白酶酶解液中氨基酸含量,其總氨基酸含量高達(dá)33594.73 mg/100 g,主要抗氧化性氨基酸含量達(dá)9.54%。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,以水解度和DPPH清除率為響應(yīng)值,確定鴨肫蛋白酶解的最佳工藝條件為:酶解時(shí)間4.0 h、加酶量3000 U/g、酶解溫度55℃、料液比1:3。在此條件下其水解度為28.30%,DPPH清除率為75.22%。其水解度與DPPH自由基清除能力之間不存在明顯的相關(guān)性。(2)探討了鴨肫不同分子量段ZT1(3 kDa)、ZT2(3-10 kDa)和ZT3(10kDa)產(chǎn)物抗氧化活性。其自由基DPPH清除率和ORAC活性值與其分子量呈顯著相關(guān)性,分子量小于3kD產(chǎn)物DPPH清除率77.59%,ORAC活性值885.25μmol TE/g。小于3kD鴨肫抗氧化肽清除超氧陰離子、羥基自由基、過氧化氫以及DNA損傷的保護(hù)作用具明顯的量效關(guān)系,其IC50值分別為14.58、0.0163、19.80和1.93mg/mL,鴨肫抗氧化肽對(duì)過氧化氫自由基抑制作用最強(qiáng),對(duì)羥自由基活性的抑制作用最弱。(3)分離及鑒定鴨肫抗氧化活性肽。采用中空纖維素膜超濾法對(duì)酶解液進(jìn)行初步分離,將ORAC值活性最高的組分(小于3kDa)使用凝膠色譜和半制備RP-HPLC進(jìn)一步分離,將純化的ORAC值活性較高的組分進(jìn)行氨基酸序列分析鑒定,確定了兩個(gè)新型的鴨肫抗氧化活性肽,分別為Ser-Ser-Tyr-Glu-Gly-Ile-Glu-Leu-Ile-Ile-Lys和Asn-Lys-Phe-Ile-Leu-Lys。(4)采用ACD/Labs軟件對(duì)部分已知抗氧化肽化學(xué)結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行描述,利用多元線性回歸(MLR)、偏最小二乘回歸(PLS)和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(BPNN)分析方法建模,對(duì)抗氧化肽進(jìn)行活性預(yù)測。MLR的線性擬合值為0.9915,PLS的線性擬合值為0.8313,BPNN線性擬合值0.99239,表明構(gòu)建的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型具有較高的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。對(duì)MLR所建的模型進(jìn)行F檢驗(yàn),可判定此方程顯著。利用MLR、PLS和BPNN所建的模型分別對(duì)分離鑒定兩個(gè)鴨肫抗氧肽DKFILK和SSYEGIELIIK驗(yàn)證,與ORAC活性值和氨基酸結(jié)構(gòu)分析結(jié)果一致,進(jìn)一步證實(shí)了組分DKFILK抗氧化活性更高。鴨肫抗氧化肽DKFILK的活性與其氨基酸組成及結(jié)構(gòu)具有一定的關(guān)聯(lián)。(5)鴨肫抗活性肽對(duì)人體前列腺增生細(xì)胞(BPH1)的抗氧化能力及其機(jī)理。不同濃度的鴨肫活性肽在作用48 h后,能明顯抑制BPH細(xì)胞的增殖,促進(jìn)其凋亡并且阻滯其細(xì)胞周期;當(dāng)鴨肫活性肽的質(zhì)量濃度為200310-3 g/L時(shí),細(xì)胞中超氧化物岐化酶、過氧化氫酶以及谷胱甘肽過氧化物酶的活力分別提高了26.16%、20.24%和69.41%;采用qRT-PCR檢測得出,細(xì)胞中CAT和GSH-Px mRNA的表達(dá)水平升高,SOD mRNA表達(dá)不明顯,與鴨肫活性肽濃度呈正相關(guān)。鴨肫活性肽通過上調(diào)細(xì)胞內(nèi)CAT和GSH-Px mRNA表達(dá)水平來削弱細(xì)胞自身的氧化損傷作用,發(fā)揮其抗氧化作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q51

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本文編號(hào)：2295352