本文關(guān)鍵詞：豬孤雌胎兒中印跡基因表達(dá)和甲基化模式的分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《吉林大學(xué)》 2015年

豬孤雌胎兒中印跡基因表達(dá)和甲基化模式的分析

王東旭  

【摘要】：孤雌生殖是指不需要精子，即不存在受精的過程，僅靠卵子自身就可以發(fā)育成為個(gè)體。自然界中，孤雌生殖現(xiàn)象在無脊椎動(dòng)物和低等脊椎動(dòng)物中較常見，但在哺乳動(dòng)物中無天然孤雌生殖發(fā)生�？茖W(xué)家們通過將MII期卵母細(xì)胞經(jīng)體外激活并移植入受體，發(fā)現(xiàn)孤雌胚胎可著床并發(fā)育至體節(jié)期，但由于缺少母源印跡基因的表達(dá)，以及異常的X染色體失活，因此不能發(fā)育到期。不同動(dòng)物孤雌胚胎的印跡基因的表達(dá)各有其特征，而豬有關(guān)內(nèi)容尚未見報(bào)道。為了探明豬孤雌發(fā)育中的印跡基因模式，本課題首先利用qPCR（quantitative real-time PCR）比較分析了18個(gè)印跡基因在孤雌胚胎和正常胚胎中的表達(dá)模式，進(jìn)一步利用BSP（Bisulfite sequencing PCR）對PRE1（常染色質(zhì)短散在重復(fù)序列）、Satilite（異染色質(zhì)DNA重復(fù)序列）以及XIST DMRs的甲基化模式進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，在孤雌胎兒以及胎盤中，父源印跡基因的表達(dá)水平顯著提高，而母源印跡基因無表達(dá)；BSP結(jié)果證實(shí)，PRE1及Satilite的甲基化狀態(tài)在孤雌及正常組織中無顯著性差異，但在孤雌胎兒及胎盤中XIST DMR呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)。以上結(jié)果揭示，紊亂的印跡基因表達(dá)模式及異常的XIST DMR甲基化模式，可能是造成豬孤雌胚胎發(fā)育阻滯的重要原因。 體細(xì)胞核移植(SCNT)，可以將體細(xì)胞重編程。孤雌核移植胚胎移植入子宮并著床后，其印跡基因的表達(dá)模式會發(fā)生改變，因而，我們推斷，經(jīng)體內(nèi)發(fā)育的孤雌細(xì)胞，再克隆后，獲得的孤雌胚胎的發(fā)育能力有可能得到改善。為此，本實(shí)驗(yàn)將豬孤雌細(xì)胞作為核供體，進(jìn)行核移植，并將重構(gòu)胚移植到假孕母豬體內(nèi)。結(jié)果顯示，經(jīng)SCNT后的孤雌胎兒（PSCNT）在體內(nèi)的發(fā)育能延長，可達(dá)第39天。但是，形態(tài)學(xué)和體重分析顯示，與正常胎兒相比，PSCNT仍然存在明顯的發(fā)育阻滯現(xiàn)象。通過qPCR以及BSP對印跡基因H19/IGF2的基因表達(dá)及甲基化模式檢測，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PSCNT胎兒中IGF2沒有表達(dá)，而H19的表達(dá)水平顯著高于正常胎兒（p 0.05）；PSCNT胎兒中，H19DMRs區(qū)域表現(xiàn)為低甲基化狀態(tài)，而IGF2DMRs處于高甲基化狀態(tài)。以上結(jié)果表明，PSCNT胎兒在體內(nèi)發(fā)育時(shí)間雖然得到延長，但與正常胎兒相比，其印跡基因H19/IGF2的表達(dá)及甲基化模式并未改變，，因此，來源于孤雌成纖維細(xì)胞的克隆孤雌胎兒的發(fā)育能力仍然有限。 本實(shí)驗(yàn)又進(jìn)一步在細(xì)胞水平上探討了SCNT是否能對印跡基因表達(dá)和甲基化模式產(chǎn)生影響。qPCR、BSP和COBRA法分析發(fā)現(xiàn)，無論是豬孤雌克隆胎兒成纖維細(xì)胞，還是豬正�？寺√撼衫w維細(xì)胞，H19，IGF2，NNAT和MEST等印跡基因的表達(dá)及甲基化模式均與供體細(xì)胞的印跡狀態(tài)一致。 綜上所述，本研究證實(shí)豬孤雌胎兒中印跡基因表達(dá)及甲基化模式呈現(xiàn)不同程度的紊亂，XIST表達(dá)的變化尤其顯著，是導(dǎo)致豬孤雌胚胎體內(nèi)發(fā)育阻滯的重要因素；本課題試圖通過核移植對孤雌胚的印跡狀態(tài)加以干預(yù)，但SCNT僅能有限延長孤雌豬體內(nèi)發(fā)育能力，在胎兒水平和細(xì)胞水平均未改善紊亂的印跡基因表達(dá)模式。本課題對豬孤雌胎兒中印跡基因表達(dá)和甲基化模式的分析，為豬胚胎發(fā)育的研究提供了有用的信息。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q954.4
【目錄】：

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