本文關(guān)鍵詞：AMPK調(diào)控組蛋白糖基化修飾的機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《華中科技大學(xué)》 2015年

AMPK調(diào)控組蛋白糖基化修飾的機(jī)制研究

杜宇  

【摘要】：目的： 1.探究治療二型糖尿病的常用藥物二甲雙胍(metformin)對腫瘤細(xì)胞增殖的影響及其相關(guān)的分子機(jī)制,初步弄清其用于治療腫瘤的理論基礎(chǔ)； 2.探索AMPK在metformin調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖過程中的作用及其作用機(jī)制； 3.研究AMPK調(diào)控組蛋白翻譯后修飾,如H2B K120ub, H2B S112GlcNAc的機(jī)制及AMPK修飾OGT的具體機(jī)制及對OGT亞細(xì)胞定位,生物學(xué)功能的影響； 4.探索OGT反饋性修飾AMPK機(jī)制及其對AMPK 方法： 1.用不同濃度的metformin處理T47D細(xì)胞株24小時(shí)或者用同一濃度(8mmM)處理T47D細(xì)胞不同時(shí)間,用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測metformin對細(xì)胞生長的影響,用流式細(xì)胞技術(shù)分析細(xì)胞周期變化情況。同時(shí)用Western檢測細(xì)胞內(nèi)AMPK的激活情況及組蛋白H28120位的單泛素化修飾及下游基因的轉(zhuǎn)錄水平。用siRNA特異敲低AMPKal,檢測metformin對于T47D細(xì)胞的抑制作用是否依賴于AMPK。 2.用不同的AMPK的激活劑和抑制劑刺激腫瘤細(xì)胞,AMPK-/-或AMPK+/+MEF細(xì)胞觀察H2B K120ub, H2B S112GlcNAc的水平變化,明確AMPK在H2B K120ub, H2BS112GlcNAc的作用； 3.采用質(zhì)譜學(xué)方法,免疫共沉淀方法,體外激酶實(shí)驗(yàn),放射自顯影等方法明確AMPK與OGT的相互作用關(guān)系,并確定AMPK磷酸化OGT的位點(diǎn)并證實(shí)AMPK對OGT的磷酸化與否決定了AMPK是否調(diào)節(jié)H2B K120ub, H2B S112GlcNAc的水平變化； 4.通過體外糖基化反應(yīng),染色質(zhì)抽提,ChlP-qPCR等方法證實(shí)AMPK磷酸化修飾OGT影響了OGT的亞細(xì)胞定位但并不影響OGT的糖基轉(zhuǎn)移酶活性,而OGT同樣可以反饋性的糖基化修飾AMPK并影響其激酶活性,同時(shí)通過油紅O染色來觀察OGT糖基化修飾AMPK后對AMPK下游成脂代謝的影響； 結(jié)果： 1. Metformin處理可以抑制H2B K120ub的水平,并呈AMPK依賴性,AMPK可以抑制H2BS112O-Glc, H2BK120ub及其下游基因轉(zhuǎn)錄； 2. AMPK與OGT相互作用,并磷酸化修飾OGT,修飾位點(diǎn)為T444； 3. AMPK通過磷酸化修飾OGT抑制了染色質(zhì)對OGT的招募,使細(xì)胞核中OGT的水平降低,但并不影響OGT的糖基轉(zhuǎn)移酶活性； 4. AMPK通過磷酸化修飾OGT參與組蛋白的翻譯后修飾并影響其下游基因轉(zhuǎn)錄水平； 5.OGT反饋性糖基化修飾AMPK并抑制其激酶活性； 結(jié)論： 1. Metformin抑制腫瘤生長的原因包含激活A(yù)MPK后磷酸化修飾OGT,抑制OGT在染色質(zhì)的聚集,從而抑制H2BS112位點(diǎn)糖基化修飾等一系列組蛋白翻譯后修飾,并影響下游基因轉(zhuǎn)錄水平,從而影響腫瘤細(xì)胞周期,細(xì)胞增殖； 2. AMPK磷酸化OGT的位點(diǎn)為T444,該位點(diǎn)在多數(shù)動(dòng)物中為保守位點(diǎn),從而影響OGT的亞細(xì)胞定位來調(diào)節(jié)OGT的功能,但對OGT的糖基轉(zhuǎn)移酶活性并無影響； 3. OGT可以反饋性的糖基化修飾AMPK并抑制AMPK的激酶活性,并影響其下游蛋白的磷酸化修飾；

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q51;Q753
【目錄】：

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