本文關(guān)鍵詞：AMPK調(diào)控組蛋白糖基化修飾的機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《南京大學(xué)》 2016年

ω-3多不飽和脂肪酸通過(guò)AMP/LKB1/AMPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)肝再生的分子機(jī)制

伏曉  

【摘要】：背景：肝切除技術(shù)是治療巨大肝臟腫瘤的有效方法,術(shù)后保護(hù)殘肝功能,促進(jìn)肝再生至關(guān)重要。臨床實(shí)踐表明,采用精準(zhǔn)肝切除技術(shù)有望提高肝臟巨大腫瘤和位于復(fù)雜區(qū)域,如：肝門區(qū)域腫瘤的切除率。但是病灶切除后,殘余肝臟能否再生發(fā)揮功能將直接影響患者的恢復(fù)和生存。因此,深入探討肝切除術(shù)后肝再生的分子機(jī)制,尋找更具針對(duì)性的治療靶點(diǎn),對(duì)臨床上安全、有效地開(kāi)展復(fù)雜高難度肝臟外科手術(shù)具有重要意義。已有臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在圍手術(shù)期采用特殊性的營(yíng)養(yǎng)支持治療可以使患者肝臟損傷明顯減輕,并發(fā)癥顯著降低。ω-3多不飽和脂肪酸(ω-3PUFA)是臨床營(yíng)養(yǎng)支持中的脂肪乳劑,主要包括二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)。大量研究證實(shí)ω-3PUFA可以通過(guò)多種信號(hào)傳導(dǎo)通路抑制炎癥反應(yīng),降低血清中TNF-α、IL-1、IL-6、NO等炎癥因子水平,防止全身炎癥反應(yīng)綜合征的發(fā)生,保護(hù)重要器官的功能。近期的研究發(fā)現(xiàn)：ω-3PUFA能夠顯著提高細(xì)胞內(nèi)AMP的水平,有效防止p-AMPK(AMP-Activated Protein Kinase)的去磷酸化,對(duì)肝再生后肝功能的維護(hù)具有一定的價(jià)值。目的：建立小鼠原代肝細(xì)胞三維立體培養(yǎng)模型,在小鼠原代肝細(xì)胞三維立體培養(yǎng)模型的基礎(chǔ)上,觀察ω-3PUFA對(duì)肝細(xì)胞膽小管形成的影響,并探討AMP/LKB1/AMPK信號(hào)通路在其中的作用機(jī)制。方法：二步灌注法提取25～30gICR小鼠原代肝細(xì)胞,并利用Ⅰ型膠原和基底膜基質(zhì)膠進(jìn)行三維立體培養(yǎng),觀察6小時(shí)、過(guò)夜培養(yǎng)和72小時(shí)肝細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。用200 mM ω-3PUFA DHA作用于原代肝細(xì)胞,觀察24小時(shí)后肝細(xì)胞之間膽小管的形成速度；用高效液相色譜法檢測(cè)ω-3PUFA DHA作用于肝細(xì)胞0、0.5、1、6、12、24小時(shí)后細(xì)胞內(nèi)AMP、ATP的水平,并計(jì)算AMP/ATP的比率；western blot方法檢測(cè)ω-3PUFA DHA作用于小鼠原代肝細(xì)胞0、0.5、1、6、12、24小時(shí)后細(xì)胞內(nèi)LKB1 (liver kinase B1)、p-LKB1、AMPK、p-AMPK的蛋白水平。此外,利用有效結(jié)構(gòu)域突變的LKB1和AMPK過(guò)表達(dá)腺病毒感染原代肝細(xì)胞,阻斷LKB1/AMPK信號(hào)通路,再次加入ω-3PUFADHA24小時(shí)后,觀察膽小管的形成速度,從而確定LKB1/AMPK信號(hào)通路在膽小管形成過(guò)程中的作用。結(jié)果：小鼠原代肝細(xì)胞在三維立體培養(yǎng)的條件下,可以發(fā)生極化并生成膽小管。小鼠原代肝細(xì)胞接種6小時(shí)后,已經(jīng)基本貼壁,細(xì)胞形態(tài)呈圓形；小鼠原代肝細(xì)胞過(guò)夜培養(yǎng)后,已經(jīng)鋪展開(kāi),互相接觸；小鼠原代肝細(xì)胞三維立體培養(yǎng)72小時(shí)后,膽小管大量形成并互相連接成網(wǎng)狀。肝細(xì)胞用ω-3PUFA處理后,膽小管的形成速度明顯加快。co-3PUFA處理小鼠原代肝細(xì)胞后,與對(duì)照組相比,在處理0.5小時(shí)后,肝細(xì)胞內(nèi)AMP水平升高,ATP水平下降,AMP/ATP比率升高,結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)；與對(duì)照組相比,在處理0.5小時(shí)后,LKBl和AMPK蛋白活化水平增高,結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)；AMP/ATP比率升高的時(shí)相與LKB1/AMPK活化的時(shí)相相同。用有效結(jié)構(gòu)域突變的過(guò)表達(dá)腺病毒分別抑制LKB1和AMPK以后,再次加入ω-3PUFA DHA,膽小管的形成明顯受到明顯抑制。結(jié)論：ω-3PUFA通過(guò)提高AMP/ATP的比率調(diào)控LKB1/AMPK通路,促進(jìn)肝細(xì)胞極化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為ω-3PUFA在肝切除術(shù)圍手術(shù)期的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.7
【目錄】：

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