本文選題：GCSE2　切入點(diǎn)：KDM4A　出處：《廣西大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：精子發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞分化過程。從細(xì)胞水平看,能夠自我更新的二倍體精原細(xì)胞分化為精母細(xì)胞,經(jīng)過減數(shù)分裂轉(zhuǎn)化單倍體的精子。從分子水平看,精子發(fā)生是一系列基因按照特定的表達(dá)模式依次表達(dá),從而精確調(diào)控精子發(fā)生的正常進(jìn)行。然而,目前我們對(duì)哺乳動(dòng)物的精子發(fā)生分子事件依然知之甚少。在本文中,我們使用了包括分子克隆、多克隆抗體制備、RNAi、精原干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和移植、酵母雙雜交、CRISPR/CAS9等多種生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)初步研究了GCSE2、KDM4A和SPATA35三個(gè)基因在精子發(fā)生過程中的功能。本研究不僅豐富了小鼠精子發(fā)生過程中的分子調(diào)控機(jī)制基礎(chǔ)理論,而且有助于理解雄性不育發(fā)生機(jī)制。具體研究分為以下三部分：研究一：新的小鼠生殖細(xì)胞特異性表達(dá)基因GCSE2的克隆、表達(dá)和初步的功能研究。研究結(jié)果顯示：1.使用生物信息學(xué)、RT-PCR、RACE和Wester nblot證明該基因特異性的表達(dá)在小鼠睪丸和卵巢。2.使用免疫組化發(fā)現(xiàn)該基因特異性表達(dá)在多種發(fā)育階段的卵母細(xì)胞和精母細(xì)胞,證明該基因僅表達(dá)在小鼠生殖細(xì)胞。3.通過基于piggyBac RNAi載體轉(zhuǎn)染精原干細(xì)胞,FACS分選獲得穩(wěn)定克隆后,移植到受體小鼠睪丸中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲低GCSE2,有損精子發(fā)生。證明該基因參與精子發(fā)生過程。4.使用酵母雙雜交篩選睪丸文庫(kù)發(fā)現(xiàn)GCSE2與SYCE1等多個(gè)信號(hào)通路蛋白相互作用,暗示著該蛋白通過較為復(fù)雜的方式參與精子發(fā)生。上述結(jié)果表明,GCSE2是一個(gè)生殖細(xì)胞特異性表達(dá)基因,參與精子發(fā)生過程。研究二：小鼠KDM4A基因是一個(gè)組蛋白特異性去甲基化酶,廣泛表達(dá)在小鼠各個(gè)組織和發(fā)育階段,然而KDM4A在小鼠生殖和發(fā)育過程中的功能仍然是未知的。我們的結(jié)果顯示：1.通過CRISPR/CAS9直接注射受精卵,可以產(chǎn)生FO代KDM4A突變小鼠,經(jīng)過連續(xù)交配至F2代可以產(chǎn)生KDM4A-/-小鼠。2.KDM4A+/+、KDM4A+/-和KDM4A-/-母鼠分別和KDM4A+/+公鼠交配,取受精卵體外培養(yǎng),在囊胚率上沒有明顯差異。3.KDM4A母鼠與KDM4A-/-公鼠交配,窩產(chǎn)子數(shù)量與野生型小鼠之間交配窩產(chǎn)字?jǐn)?shù)沒有明顯差異。4.檢測(cè)小鼠體重發(fā)現(xiàn)：3周齡和6周齡KDM4A+/+、KDM4A+和KDM4A-公鼠體重沒有明顯差異。3周齡和6周齡KDM4A++、KDM4A+/-和KDM4A母鼠體重沒有明顯差異。5.分別對(duì)KDM4A+/+和KDM4A-/-小鼠卵巢和睪丸石蠟包埋切片進(jìn)行HE染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)KDM4A+/+和KDM4A-/-睪丸和卵巢的組織結(jié)構(gòu)沒有明顯差異。 6.分別分離培養(yǎng)KDM4A+/+和KDM4A-/- 6周齡公鼠尾尖成纖維細(xì)胞,在第4代繪制細(xì)胞增殖曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與KDM4A相比,KDM4A-/-尾尖成纖維細(xì)胞具有更好的增殖能力。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明：CRISPR/CAS9基因組編輯系統(tǒng)能夠簡(jiǎn)便高效的制備F0代基因突變小鼠,并且F0代突變小鼠經(jīng)過雜交,在F2可以獲得純合突變小鼠。KDM4A對(duì)小鼠的生殖和發(fā)育不是必需的。KDM4A knockout有助于尾尖成纖維細(xì)胞體外增殖。研究三：小鼠睪丸特異性表達(dá)基因Spata35的克隆、表達(dá)和初步的功能研究。研究結(jié)果顯示：1.使用生物信息學(xué)、RACE、RT-PCR、Real time PCR和Wester nblot證明該基因特異性的表達(dá)在小鼠睪丸。2.通過CRISPR/CAS9直接注射受精卵,高效制備F0代Spata35突變小鼠,經(jīng)過連續(xù)交配至F2代產(chǎn)生Deleted 89bp Spata35-/-小鼠。4.使用酵母雙雜交篩選睪丸文庫(kù)發(fā)現(xiàn)Spata35與PELI1等多個(gè)信號(hào)通路蛋白相互作用,暗示著該蛋白可能通過較為復(fù)雜的方式參與精子發(fā)生。上述結(jié)果表明,Spata35是一個(gè)睪丸特異性表達(dá)基因,通過CRISPR/CAS9直接注射受精卵,連續(xù)雜交,可以獲得Spata35 knockout小鼠。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q954.4

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Andrew R.Bassett;Ji-Long Liu;;CRISPR/Cas9 and Genome Editing in Drosophila[J];Journal of Genetics and Genomics;2014年01期

，

本文編號(hào)：1587867