本文選題：H3N2亞型犬流感病毒　切入點(diǎn)：單克隆抗體　出處：《南京農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：H3N2亞型犬流感病毒(canine influenza virus,CIV)是一種在犬群中流行的能夠引起犬咳嗽、高熱、肺炎甚至死亡的高度接觸性傳染病。犬流感病毒不僅對(duì)犬類的生存和健康帶來嚴(yán)重的危害,同時(shí)也給人類健康帶來巨大的風(fēng)險(xiǎn),如果能夠制備針對(duì)犬流感病毒的有效單抗,并闡明犬流感病毒的感染機(jī)制,無疑將有效地促進(jìn)對(duì)犬流感病毒感染的預(yù)防和控制。然而,目前卻尚無針對(duì)H3N2亞型犬流感病毒的單克隆抗體,亦沒有研究該病毒的合適細(xì)胞模型。因此,本研究制備了針對(duì)H3N2亞型犬流感病毒的保護(hù)性單克隆抗體,并建立了永生化的犬細(xì)支氣管上皮細(xì)胞作為研究犬流感病毒的細(xì)胞模型。另外,本研究還獲得了原代犬細(xì)支氣管上皮細(xì)胞和原代犬肺泡巨噬細(xì)胞感染H3N2亞型犬流感病毒后的microRNA差異表達(dá)譜,并對(duì)其中的3個(gè)microRNA的作用進(jìn)行了研究,研究結(jié)果表明宿主細(xì)胞在被犬流感病毒感染后,能夠通過改變microRNA的水平來影響病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制,研究結(jié)果有助于闡明犬流感病毒感染宿主細(xì)胞的分子機(jī)制。1. H3N2亞型犬流感病毒單克隆抗體的制備及相關(guān)特性分析在對(duì)H3N2亞型犬流感病毒A/Canine/Jiangsu/06/2010 (JS/10)株進(jìn)行擴(kuò)增和純化的基礎(chǔ)上,以全病毒作為免疫抗原皮內(nèi)多點(diǎn)注射免疫BALB/c小鼠,經(jīng)過細(xì)胞融合及雜交瘤細(xì)胞的亞克隆,獲得了7株能夠分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,隨后利用7株雜交瘤細(xì)胞制備了腹水并進(jìn)行純化,最終獲得了 7株單克隆抗體,并對(duì)單克隆抗體的特性進(jìn)行了分析。其中,單抗D7的中和效價(jià)達(dá)了 1:12800,并且對(duì)不同的H3N2亞型流感病毒株具有交叉反應(yīng)性;Western blot鑒定結(jié)果表明,該單抗所針對(duì)的抗原表位位于相對(duì)保守的HA2片段。本研究制備的針對(duì)H3N2亞型犬流感病毒的單克隆抗體,為該病毒的檢測及其感染的治療提供了物質(zhì)基礎(chǔ),具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。2.單克隆抗體對(duì)不同H3N2亞型流感病毒株感染的保護(hù)作用為評(píng)估單克隆抗體D7對(duì)H3N2亞型犬流感病毒感染的保護(hù)作用,本研究以BALB/c小鼠為感染模型,評(píng)估了單抗D7對(duì)H3N2亞型犬流感病毒江蘇分離株JS/10、廣東分離株GD/12以及H3N2亞型豬流感病毒山東分離株SD/05感染的保護(hù)效果。將單抗D7預(yù)先給小鼠注射后,分別感染上述3種流感病毒,并以非相關(guān)單抗、單獨(dú)病毒感染以及PBS作為對(duì)照,于病毒感染后第2、4、6、10和14天等5個(gè)時(shí)間點(diǎn),分別測定小鼠體重,血液、糞便及不同臟器中的病毒載量,以及肺組織中的細(xì)胞因子(IFN-γ和TNF-α)水平。同時(shí),對(duì)小鼠的肺、心、腦3種臟器進(jìn)行組織病理學(xué)觀察及免疫組化分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,單抗D7對(duì)以上3株H3N2亞型流感病毒株的感染均起到了一定的免疫保護(hù)作用,其中對(duì)JS/10株的保護(hù)效果最好,表現(xiàn)為腹腔注射單抗D7后,較好的維持了感染小鼠的體重,降低了各臟器的病毒載量,并減輕了病毒感染對(duì)各臟器所造成的組織病理損傷,降低了與病毒感染相關(guān)的IFN-γ和TNF-α表達(dá)水平。本研究說明單抗D7對(duì)H3N2亞型流感病毒感染具有良好的防控效果。3. 永生化犬細(xì)支氣管上皮細(xì)胞系的建立及其特征分析為深入研究犬流感病毒的致病機(jī)制,本研究分離并培養(yǎng)了原代犬細(xì)支氣管上皮細(xì)胞(CBECs),并在此基礎(chǔ)上,將端粒酶(hTERT)基因以真核重組表達(dá)質(zhì)粒(pEGFP-hTERT)的形式轉(zhuǎn)入CBECs中,建立了永生化的犬細(xì)支氣管上皮細(xì)胞系(hTERT-CBECs )。特性分析表明,永生化的hTERT-CBECs保留了原代細(xì)胞的形態(tài)和功能特征;實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)、增殖試驗(yàn)、核型分析、端粒酶活性檢測以及Western blot等方法證實(shí),永生化犬細(xì)支氣管上皮細(xì)胞傳至第50代,仍具有很強(qiáng)的端粒酶活性、延長的增殖壽命以及二倍體染色體特征;軟瓊脂分析和裸鼠體內(nèi)致瘤性試驗(yàn)均表明,該永生化細(xì)胞系不具有致瘤性。本試驗(yàn)獲得的原代犬細(xì)支氣管上皮細(xì)胞及永生化犬細(xì)支氣管上皮細(xì)胞系,為探討犬流感病毒等呼吸道病原的感染機(jī)制提供了重要的生物材料。4. CIV感染犬原代細(xì)支氣管上皮細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞的microRNA表達(dá)譜分析分離培養(yǎng)了原代犬細(xì)支氣管上皮細(xì)胞和原代犬肺泡巨噬細(xì)胞,并通過small RNA測序和microRNA基因芯片測序,獲得了以上兩種細(xì)胞在感染H3N2亞型犬流感病毒后的microRNA表達(dá)譜。分析結(jié)果表明,在原代犬細(xì)支氣管上皮細(xì)胞和原代犬肺泡巨噬細(xì)胞中,分別檢測到了421和292個(gè)microRNA (miRNA)的表達(dá),其中差異表達(dá)倍數(shù)在2倍以上的miRNA分別有117個(gè)和71個(gè)。通過TargetScan、PITA和miRanda數(shù)據(jù)庫對(duì)這些差異表達(dá)miRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測,并在Gene Ontology和KEGG數(shù)據(jù)庫中對(duì)這些靶基因的功能進(jìn)行預(yù)測注釋,結(jié)果表明這些差異表達(dá)miRNA主要參與抗病毒應(yīng)答,凋亡應(yīng)答和趨化因子細(xì)胞因子炎性應(yīng)答等信號(hào)通路。另外,試驗(yàn)還通過qRT-PCR對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證,結(jié)果表明qRT-PCR結(jié)果與測序結(jié)果中miRNA的表達(dá)水平變化趨勢一致,說明測序結(jié)果較可靠。研究所得到的miRNA表達(dá)譜,為犬流感病毒致病機(jī)制的研究提供了重要信息。5.宿主細(xì)胞microRNA對(duì)H3N2亞型犬流感病毒復(fù)制的影響選擇病毒感染后表達(dá)水平顯著下調(diào)的3個(gè)miRNA: cfa-miR-125b、cfa-miR-151和cfa-miR-423a,并對(duì)其在細(xì)胞抵抗病毒感染中的作用展開研究。試驗(yàn)以永生化的犬細(xì)支氣管上皮細(xì)胞(hTERT-CBECs)和犬巨噬細(xì)胞系(DH82)為基礎(chǔ),分別以腺病毒載體和慢病毒載體,構(gòu)建了3個(gè)miRNA的穩(wěn)定過表達(dá)和抑制細(xì)胞系,然后分析3個(gè)miRNA過表達(dá)或者表達(dá)被抑制后,對(duì)病毒在相應(yīng)細(xì)胞中的復(fù)制能力進(jìn)行評(píng)估,同時(shí)對(duì)感染細(xì)胞中病毒的NP和NS1表達(dá)水平進(jìn)行檢測。研究結(jié)果顯示,cfa-miR-125b和cfa-miR-151的過表達(dá)能夠促進(jìn)病毒的復(fù)制,而當(dāng)這兩種miRNA的表達(dá)被抑制后,則會(huì)導(dǎo)致病毒復(fù)制能力顯著下降,而cfa-miR-423a的過表達(dá)和抑制則對(duì)病毒的復(fù)制能力沒有明顯影響。同時(shí)qRT-PCR和Western blot檢測結(jié)果也顯示cfa-miR-125b和cfa-miR-151的過表達(dá)和抑制分別能夠提高和降低NP和NS1的表達(dá)水平,并且這種現(xiàn)象在hTERT-CBECs和DH82細(xì)胞中均存在。此外,在上述兩種細(xì)胞中,無論cfa-miR-423a過表達(dá)還是抑制都能抑制NP的表達(dá)水平,而對(duì)NS1的表達(dá)水平?jīng)]有影響。本試驗(yàn)表明,當(dāng)細(xì)胞受到H3N2犬流感病毒感染后,可以通過改變自身的miRNAs水平來調(diào)控病毒的復(fù)制。該研究有助于進(jìn)一步闡明細(xì)胞對(duì)病毒感染的抵抗機(jī)制。
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【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65
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本文編號(hào)：1587785