本文選題：H3N2亞型犬流感病毒　切入點：單克隆抗體　出處：《南京農(nóng)業(yè)大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：H3N2亞型犬流感病毒(canine influenza virus,CIV)是一種在犬群中流行的能夠引起犬咳嗽、高熱、肺炎甚至死亡的高度接觸性傳染病。犬流感病毒不僅對犬類的生存和健康帶來嚴重的危害,同時也給人類健康帶來巨大的風險,如果能夠制備針對犬流感病毒的有效單抗,并闡明犬流感病毒的感染機制,無疑將有效地促進對犬流感病毒感染的預防和控制。然而,目前卻尚無針對H3N2亞型犬流感病毒的單克隆抗體,亦沒有研究該病毒的合適細胞模型。因此,本研究制備了針對H3N2亞型犬流感病毒的保護性單克隆抗體,并建立了永生化的犬細支氣管上皮細胞作為研究犬流感病毒的細胞模型。另外,本研究還獲得了原代犬細支氣管上皮細胞和原代犬肺泡巨噬細胞感染H3N2亞型犬流感病毒后的microRNA差異表達譜,并對其中的3個microRNA的作用進行了研究,研究結(jié)果表明宿主細胞在被犬流感病毒感染后,能夠通過改變microRNA的水平來影響病毒在細胞內(nèi)的復制,研究結(jié)果有助于闡明犬流感病毒感染宿主細胞的分子機制。1. H3N2亞型犬流感病毒單克隆抗體的制備及相關(guān)特性分析在對H3N2亞型犬流感病毒A/Canine/Jiangsu/06/2010 (JS/10)株進行擴增和純化的基礎上,以全病毒作為免疫抗原皮內(nèi)多點注射免疫BALB/c小鼠,經(jīng)過細胞融合及雜交瘤細胞的亞克隆,獲得了7株能夠分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株,隨后利用7株雜交瘤細胞制備了腹水并進行純化,最終獲得了 7株單克隆抗體,并對單克隆抗體的特性進行了分析。其中,單抗D7的中和效價達了 1:12800,并且對不同的H3N2亞型流感病毒株具有交叉反應性;Western blot鑒定結(jié)果表明,該單抗所針對的抗原表位位于相對保守的HA2片段。本研究制備的針對H3N2亞型犬流感病毒的單克隆抗體,為該病毒的檢測及其感染的治療提供了物質(zhì)基礎,具有潛在的應用價值。2.單克隆抗體對不同H3N2亞型流感病毒株感染的保護作用為評估單克隆抗體D7對H3N2亞型犬流感病毒感染的保護作用,本研究以BALB/c小鼠為感染模型,評估了單抗D7對H3N2亞型犬流感病毒江蘇分離株JS/10、廣東分離株GD/12以及H3N2亞型豬流感病毒山東分離株SD/05感染的保護效果。將單抗D7預先給小鼠注射后,分別感染上述3種流感病毒,并以非相關(guān)單抗、單獨病毒感染以及PBS作為對照,于病毒感染后第2、4、6、10和14天等5個時間點,分別測定小鼠體重,血液、糞便及不同臟器中的病毒載量,以及肺組織中的細胞因子(IFN-γ和TNF-α)水平。同時,對小鼠的肺、心、腦3種臟器進行組織病理學觀察及免疫組化分析。實驗結(jié)果表明,單抗D7對以上3株H3N2亞型流感病毒株的感染均起到了一定的免疫保護作用,其中對JS/10株的保護效果最好,表現(xiàn)為腹腔注射單抗D7后,較好的維持了感染小鼠的體重,降低了各臟器的病毒載量,并減輕了病毒感染對各臟器所造成的組織病理損傷,降低了與病毒感染相關(guān)的IFN-γ和TNF-α表達水平。本研究說明單抗D7對H3N2亞型流感病毒感染具有良好的防控效果。3. 永生化犬細支氣管上皮細胞系的建立及其特征分析為深入研究犬流感病毒的致病機制,本研究分離并培養(yǎng)了原代犬細支氣管上皮細胞(CBECs),并在此基礎上,將端粒酶(hTERT)基因以真核重組表達質(zhì)粒(pEGFP-hTERT)的形式轉(zhuǎn)入CBECs中,建立了永生化的犬細支氣管上皮細胞系(hTERT-CBECs )。特性分析表明,永生化的hTERT-CBECs保留了原代細胞的形態(tài)和功能特征;實時定量PCR(qRT-PCR)、增殖試驗、核型分析、端粒酶活性檢測以及Western blot等方法證實,永生化犬細支氣管上皮細胞傳至第50代,仍具有很強的端粒酶活性、延長的增殖壽命以及二倍體染色體特征;軟瓊脂分析和裸鼠體內(nèi)致瘤性試驗均表明,該永生化細胞系不具有致瘤性。本試驗獲得的原代犬細支氣管上皮細胞及永生化犬細支氣管上皮細胞系,為探討犬流感病毒等呼吸道病原的感染機制提供了重要的生物材料。4. CIV感染犬原代細支氣管上皮細胞和肺泡巨噬細胞的microRNA表達譜分析分離培養(yǎng)了原代犬細支氣管上皮細胞和原代犬肺泡巨噬細胞,并通過small RNA測序和microRNA基因芯片測序,獲得了以上兩種細胞在感染H3N2亞型犬流感病毒后的microRNA表達譜。分析結(jié)果表明,在原代犬細支氣管上皮細胞和原代犬肺泡巨噬細胞中,分別檢測到了421和292個microRNA (miRNA)的表達,其中差異表達倍數(shù)在2倍以上的miRNA分別有117個和71個。通過TargetScan、PITA和miRanda數(shù)據(jù)庫對這些差異表達miRNA的靶基因進行預測,并在Gene Ontology和KEGG數(shù)據(jù)庫中對這些靶基因的功能進行預測注釋,結(jié)果表明這些差異表達miRNA主要參與抗病毒應答,凋亡應答和趨化因子細胞因子炎性應答等信號通路。另外,試驗還通過qRT-PCR對測序結(jié)果進行了驗證,結(jié)果表明qRT-PCR結(jié)果與測序結(jié)果中miRNA的表達水平變化趨勢一致,說明測序結(jié)果較可靠。研究所得到的miRNA表達譜,為犬流感病毒致病機制的研究提供了重要信息。5.宿主細胞microRNA對H3N2亞型犬流感病毒復制的影響選擇病毒感染后表達水平顯著下調(diào)的3個miRNA: cfa-miR-125b、cfa-miR-151和cfa-miR-423a,并對其在細胞抵抗病毒感染中的作用展開研究。試驗以永生化的犬細支氣管上皮細胞(hTERT-CBECs)和犬巨噬細胞系(DH82)為基礎,分別以腺病毒載體和慢病毒載體,構(gòu)建了3個miRNA的穩(wěn)定過表達和抑制細胞系,然后分析3個miRNA過表達或者表達被抑制后,對病毒在相應細胞中的復制能力進行評估,同時對感染細胞中病毒的NP和NS1表達水平進行檢測。研究結(jié)果顯示,cfa-miR-125b和cfa-miR-151的過表達能夠促進病毒的復制,而當這兩種miRNA的表達被抑制后,則會導致病毒復制能力顯著下降,而cfa-miR-423a的過表達和抑制則對病毒的復制能力沒有明顯影響。同時qRT-PCR和Western blot檢測結(jié)果也顯示cfa-miR-125b和cfa-miR-151的過表達和抑制分別能夠提高和降低NP和NS1的表達水平,并且這種現(xiàn)象在hTERT-CBECs和DH82細胞中均存在。此外,在上述兩種細胞中,無論cfa-miR-423a過表達還是抑制都能抑制NP的表達水平,而對NS1的表達水平?jīng)]有影響。本試驗表明,當細胞受到H3N2犬流感病毒感染后,可以通過改變自身的miRNAs水平來調(diào)控病毒的復制。該研究有助于進一步闡明細胞對病毒感染的抵抗機制。
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【學位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
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本文編號：1587785