本文選題：牛心樸子　切入點(diǎn)：逆境脅迫轉(zhuǎn)錄組分析　出處：《中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：牛心樸子Cynanchum komarovii)是一種荒漠草本植物,具有殺蟲、抑菌、抗植物病毒等生物活性,被用于制備綠色農(nóng)藥,其有極強(qiáng)的荒漠適應(yīng)能力,在100mmm以下降雨量仍可存活,耐地面最高溫度67-96℃℃、最低溫度-29℃℃到-36℃℃,集耐早、耐高溫、耐冷等抗逆性于一身,是獲得抗逆優(yōu)異基因的好材料。本論文研究目的是明確植物耐旱、耐低溫的分子機(jī)理,在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中填補(bǔ)牛心樸子可利用的基因序列和遺傳信息,為農(nóng)作物耐旱、耐冷新品種培育提供基因資源。本文首次對(duì)牛心樸子逆境脅迫轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析,明確干旱、低溫脅迫下牛心樸子差異表達(dá)基因,探究牛心樸子耐旱、耐低溫的分子機(jī)制及其響應(yīng)非生物脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)理,挖掘新型耐旱、耐低溫基因。本論文還研究牛心樸子耐旱基因CkNF-YB1、抗病基因CkEDS1的功能。主要研究結(jié)果如下：1、采用高通量Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)干旱脅迫下牛心樸子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,獲得27.5GB測(cè)序數(shù)據(jù),組裝得到148715條Unigene,平均長(zhǎng)度為604bp,其中85106條在7大公共數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)中獲得功能注釋。KOG功能分類中有4364個(gè)Unigene與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)。KEGG生物代謝途徑分析表明有29737個(gè)Unigene分別參與31個(gè)代謝途徑,其中有827個(gè)基因被鑒定與環(huán)境適應(yīng)功能相關(guān),2840個(gè)基因與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能相關(guān),426個(gè)基因與次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成相關(guān)。在干旱脅迫下鑒定出3134個(gè)差異表達(dá)基因,其中上調(diào)基因601個(gè)。明確參與植物角質(zhì)和蠟質(zhì)生物合成的代謝途徑具有最大Rich factor,參與此生物過(guò)程的基因富集程度高,統(tǒng)計(jì)鑒定出參與蠟質(zhì)合成、轉(zhuǎn)運(yùn)及調(diào)節(jié)功能相關(guān)的差異基因26個(gè)。2、對(duì)低溫脅迫下牛心樸子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,獲得30.5GB測(cè)序數(shù)據(jù),組裝得到100006條Unigene,平均長(zhǎng)度為649bp,其中有47082條Unigene在7大公共數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)中獲得功能注釋。KOG功能注釋中1779個(gè)與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制相關(guān)的基因,以及有786基因被鑒定為與次生代謝合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解功能有關(guān)。KEGG生物代謝途徑分析鑒定出17695條Unigene參與轉(zhuǎn)錄、碳水化合物代謝、運(yùn)輸及分解代謝等,其中有445個(gè)基因被鑒定為與環(huán)境適應(yīng)功能相關(guān),305個(gè)基因與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能相關(guān)。在低溫脅迫下鑒定出7742個(gè)差異表達(dá)基因,其中上調(diào)基因3081個(gè)和下調(diào)基因4661個(gè)。對(duì)差異基因的GO功能與KEGG代謝途徑富集分析,植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和淀粉與蔗糖代謝為主要的生物過(guò)程。參與類黃酮生物合成、黃酮與黃酮醇生物合成途徑具有最大Rich factor,表明在低溫脅迫下參與類黃酮生物合成途徑的基因富集程度高。對(duì)牛心樸子中響應(yīng)低溫應(yīng)答差異基因分析,鑒定出550個(gè)轉(zhuǎn)錄因子,包括MYB、 C3H、bHLH、AP2-EREBP等轉(zhuǎn)錄因子。3、以干旱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為參考序列,從牛心樸子中克隆轉(zhuǎn)錄因子CkNF-YB1,在其根和莖中表達(dá)量高,受到ABA與PEG6000誘導(dǎo)表達(dá)。CkNF-YB1與GFP熒光蛋白構(gòu)建融合表達(dá)載體,其表達(dá)定位于細(xì)胞核內(nèi)。利用酵母單雜交技術(shù)驗(yàn)證單一的CkNF-YB1蛋白不具有轉(zhuǎn)錄激活活性。將CkNF-YB1基因轉(zhuǎn)入擬南芥野生型與nf-yb突變體中。表型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)相對(duì)于野生型和突變體株系,過(guò)表達(dá)株系OE10和OE13在干旱脅迫條件下種子萌發(fā)率分別為76.00%和78.00%,含水量分別為65.50%和66.85%,相對(duì)電導(dǎo)率分別為36.56%和35.57%。耐旱相關(guān)基因的表達(dá)水平實(shí)驗(yàn)分析表明,CkNF-YB過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系中RD29A、RD29B、CBF4和KIN1表達(dá)量高于野生型植株。實(shí)驗(yàn)證明CKNF-YB1提高了轉(zhuǎn)基因植株在干旱脅迫條件下的耐受能力。4、以牛心樸子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為參考序列,從牛心樸子中克隆出CKEDS1,該基因在根和莖中表達(dá)量高,受SA誘導(dǎo)表達(dá)。將CkEDS1與GFP熒光蛋白構(gòu)建出融合表達(dá)載體,其表達(dá)定位于細(xì)胞核。將CkEDS1轉(zhuǎn)入擬南芥野生型與edS1突變體細(xì)胞中,對(duì)轉(zhuǎn)基因株系在棉花黃萎病菌侵染下抗病情況分析,發(fā)現(xiàn)在21dpi時(shí)轉(zhuǎn)CkEDS1基因株系的病情指數(shù)分別為19.44和22.77低于野生型(36.11),而28dpi時(shí)轉(zhuǎn)CkEDS1基因株系的病情指數(shù)分別為42.78和42.22顯著低于野生型(72.78)。抗病相關(guān)基因的表達(dá)水平分析表明,CkEDSl過(guò)表達(dá)株系中PR1、PR5和ICSl的表達(dá)量顯著高于野生型。轉(zhuǎn)CkEDS1基因棉花在田間表現(xiàn)出對(duì)黃萎病抗性。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了CkEDS1能夠提高轉(zhuǎn)基因植物抗病能力。
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【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q943.2
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本文編號(hào)：1571643