本文關(guān)鍵詞： 嗜酸普魯蘭芽孢桿菌 普魯蘭酶 大腸桿菌 可溶性表達(dá) 熱穩(wěn)定性　出處：《江南大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：普魯蘭酶是一種雙向催化酶,能夠催化普魯蘭多糖、淀粉等多聚葡萄糖類底物分支部位的α-1,6-糖苷鍵的水解,特定條件下也能催化α-1,6-糖苷鍵的反向合成,因而可應(yīng)用于糖苷化合物分子結(jié)構(gòu)解析、淀粉原料糖化以及功能性藥用多糖合成等諸多領(lǐng)域。當(dāng)前該酶被廣泛地應(yīng)用于淀粉糖工業(yè)中,成為高品質(zhì)糖漿生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵酶制劑。淀粉糖化過程需要在高溫(60°C)下進(jìn)行,糖化時(shí)間一般為48 60小時(shí),普魯蘭酶必須具備在高溫下保持較高酶活性和穩(wěn)定性的能力,篩選耐高溫普魯蘭酶對(duì)于淀粉糖化過程中降低使用成本和改進(jìn)工藝具有重要意義。本論文以B.acidopullulyticus普魯蘭酶(Pul A)為研究對(duì)象,采用不同的宿主構(gòu)建重組菌株,對(duì)比考察目標(biāo)蛋白在不同表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)情況,遴選適合于后續(xù)基礎(chǔ)研究的表達(dá)系統(tǒng),并通過過程參數(shù)優(yōu)化、載體和宿主的試錯(cuò)組合以及分子精簡(jiǎn)等策略實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白高效重組表達(dá);依據(jù)結(jié)構(gòu)生物學(xué)、生物信息學(xué)以及同源多序列比對(duì)分析結(jié)果,甄選與熱穩(wěn)定能力相關(guān)的關(guān)鍵氨基酸及結(jié)構(gòu)模塊,通過定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建突變體,對(duì)比考察突變前后酶蛋白酶學(xué)性質(zhì)差異,篩選和獲得最適溫度和/或溫度穩(wěn)定性優(yōu)于野生型的熱穩(wěn)定突變體。主要研究結(jié)果如下:1.當(dāng)采用p ET-22b(+),p ET-28a(+)表達(dá)Pul A時(shí),酶活分別是29.7±0.6 U×m L-1和27.3±0.8 U×m L-1,是同等條件下p ET-20b(+)-Pul A的6.8倍和6.2倍。將p ET-22b(+)-Pul A質(zhì)粒上的T7啟動(dòng)子置換成Tac啟動(dòng)子,可溶性表達(dá)量大幅下降,所表達(dá)的目標(biāo)蛋白幾乎全部以包涵體形式存在,上述結(jié)果表明菌體生長(zhǎng)初始階段的本底表達(dá)導(dǎo)致p ET-20b(+)-Pul A和p GEX4T2-Pul A大量形成包涵體,通過嚴(yán)謹(jǐn)控制本底表達(dá)水平可顯著提高了普魯蘭酶在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)水平。宿主方面,采用Rosetta(DE3)提高稀有密碼子t RNA水平,可提高單位菌體的表達(dá)量。2.采用N端截短方式對(duì)Pul A進(jìn)行分子精簡(jiǎn),探索N端結(jié)構(gòu)域?qū)扇苄员磉_(dá)、胞外分泌以及其他酶學(xué)性質(zhì)的影響。結(jié)果表明,缺失CBM41可有效提高可溶性表達(dá)量,X25結(jié)構(gòu)域?qū)扇苄员磉_(dá)量影響不明顯,X45結(jié)構(gòu)域可能在促進(jìn)催化結(jié)構(gòu)域正確折疊或維持催化結(jié)構(gòu)域正確構(gòu)象中發(fā)揮作用,缺失X45后目標(biāo)蛋白主要以不溶的包涵體形式存在。缺失CBM41的變體可在pel B信號(hào)肽的引導(dǎo)下分泌至胞外,且胞外酶活上升部分是細(xì)胞自溶引起的。突變體M1(ΔCBM41),M3(ΔX25)和M5(ΔCBM41ΔX25)的最適溫度(60°C)和最適p H(5.0)與野生型相同,三者對(duì)分子量較大底物(可溶性淀粉)的水解效率下降較明顯,但對(duì)小分子底物(糊精)的水解效率影響較小,淀粉糖化結(jié)果表明切除CBM41和X25結(jié)構(gòu)域的變體不影響其在淀粉糖化過程中的實(shí)際應(yīng)用。3.采用四種計(jì)算機(jī)輔助理性設(shè)計(jì)方法(B-FITTER、Proline理論、Po PMu Si C-2.1和序列一致性)篩選出39個(gè)可能影響熱穩(wěn)定性的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)。兩輪定點(diǎn)突變后(單定點(diǎn)突變+迭代多點(diǎn)突變)獲得熱穩(wěn)定性顯著優(yōu)于野生型普魯蘭酶的突變體Pul A-TS:60°C下的半衰期為387.3 min,是野生型的11倍;Tm值為74.5°C,較野生型提高了9.5°C。Pul A-TS最適溫度為65°C,高于野生型5°C,突變體在較高的溫度下具有較好的熱力學(xué)穩(wěn)定性及動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性。晶體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明,突變體熱穩(wěn)定性提高可能與518I位點(diǎn)較高的疏水作用和低自由能、662R位點(diǎn)引入兩個(gè)新的氫鍵、706P位點(diǎn)較高的剛性以及更為緊湊的空間結(jié)構(gòu)相關(guān)。4.將Pul A結(jié)構(gòu)域B置換為G.thermoleovorans普魯蘭酶結(jié)構(gòu)域B,構(gòu)建嵌合突變體Pul A-GTPB。嵌合突變對(duì)菌體生長(zhǎng)和可溶性表達(dá)量無影響,但Pul A-GTPB的比酶活力僅為野生型的43%。野生型和嵌合突變體的最適底物均是普魯蘭多糖,且對(duì)高度分支的糖原沒有水解活性,但是突變體對(duì)普魯蘭多糖底物的親和力(Km)下降,催化效率僅有野生型的51%,此外突變體對(duì)糊精和可溶性淀粉的水解活性較野生型有明顯上升。與野生型相比,Pul A-GTPB最適p H由5.0上升至6.5,且在酸性環(huán)境中的穩(wěn)定性低于野生型;最適溫度由60°C上升至70°C,在60°C溫浴30 min后的殘余酶活由55%上升至95%;60°C下的半衰期由34.9 min上升至168.4 min;熱力學(xué)穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果表明,突變體解折疊一半時(shí)的溫度為72.0°C,較野生型提高了7°C。
[Abstract]:鏅瞾鍏伴叾鏄竴縐嶅弻鍚戝偓鍖栭叾,鑳藉鍌寲鏅瞾鍏板緋，

本文編號(hào)：1510888