發(fā)布時(shí)間：2018-01-29 07:47

  本文關(guān)鍵詞： 液滴微流控 熒光檢測(cè) 介電泳分選 高通量 病毒顆粒　出處：《哈爾濱工業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：病毒是自然界中數(shù)量最多的微生物,它導(dǎo)致的大規(guī)模傳染性疾病如SARS、埃博拉等,給人類的生命財(cái)產(chǎn)安全帶來巨大損失。病毒性疾病之所以傳播迅速,究其原因是其變異速度極快,同時(shí)傳統(tǒng)的醫(yī)學(xué)檢測(cè)方法對(duì)其檢測(cè)效率較低所致。因此,如何快速、準(zhǔn)確的對(duì)病毒進(jìn)行定量檢測(cè)與分選是現(xiàn)代生物學(xué)研究的緊迫問題。液滴微流控技術(shù)以其高通量、速度快的特征已成為近年來微流控技術(shù)的主流科研熱點(diǎn),它在生物顆粒的精確定量與快速檢測(cè)方面獨(dú)具優(yōu)勢(shì)。基于此,本文以液滴微流控技術(shù)為出發(fā)點(diǎn),面向生物顆粒的高通量、快速檢測(cè)等關(guān)鍵科學(xué)技術(shù)問題開展研究,以期實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒等生物樣品的精準(zhǔn)檢測(cè),為疾病的早期診斷、快速治療等提供理論依據(jù)與技術(shù)支撐。本文首先以微納尺度流體流動(dòng)的視角出發(fā),分析了微通道內(nèi)兩相流的基本理論,提出了綜合利用液滴及介電泳技術(shù)實(shí)現(xiàn)高通量顆粒檢測(cè)與分選的新方法;給出了液滴的生成、運(yùn)動(dòng)及電場(chǎng)操縱顆粒的控制方程,并分別建立了相應(yīng)的仿真模型,數(shù)值模擬了液滴生成規(guī)律及分選的結(jié)構(gòu)設(shè)置原則。為驗(yàn)證理論研究的正確性,對(duì)液滴的生成、檢測(cè)與分選進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究,為后續(xù)應(yīng)用研究奠定理論基礎(chǔ)。為能夠在大量不具有突變RNA的病毒樣本中,快速定位并準(zhǔn)確定量檢測(cè)突變RNA病毒,進(jìn)而遏制病毒性傳染病的變異與傳播,本文將液滴微流控技術(shù)的高通量特性應(yīng)用于RNA病毒定量檢測(cè)中。以直徑為30 nm的鼠類諾瓦克病毒株MNV-1為研究對(duì)象,搭建基礎(chǔ)高通量液滴微流控系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)單個(gè)病毒RNA分子的精確包裹。根據(jù)泊松分布原理,準(zhǔn)確稀釋病毒樣品使得每個(gè)液滴中的病毒RNA模板數(shù)量不超過1個(gè)。依托該系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)1000個(gè)/秒的高通量液滴生成速度,同時(shí)控制液滴直徑精確為25μm,體積為12.5 p L。在單個(gè)液滴中實(shí)現(xiàn)了一步法逆轉(zhuǎn)錄的PCR擴(kuò)增,并搭建了高通量液滴的熒光信號(hào)檢測(cè)平臺(tái),通過檢測(cè)分析統(tǒng)計(jì)了有(N+)/無(N-)熒光的液滴數(shù)量,進(jìn)而計(jì)算了樣品溶液中病毒的濃度(基因組/m L)。實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證了液滴微流控系統(tǒng)進(jìn)行定量分析的高靈敏度、高通量特性。在病毒定量檢測(cè)的基礎(chǔ)上,準(zhǔn)確檢測(cè)其感染特性是阻斷其生命進(jìn)程的核心步驟,而這一步驟則需要在基礎(chǔ)液滴微流控系統(tǒng)中合理耦合加樣、混合等功能。搭建了具有在液滴中進(jìn)行取樣和注入功能的復(fù)合液滴微流控系統(tǒng),提出了一種不依托細(xì)胞培養(yǎng)的、可快速及時(shí)檢測(cè)病毒滴度的新方法。通過該系統(tǒng)同時(shí)包裹了具有感染力的病毒顆粒和宿主細(xì)胞,生成了大量的、尺寸均勻的微尺度液滴,并對(duì)孵育后的液滴微反應(yīng)器進(jìn)行病毒RNA分子取樣和RT-PCR試劑注入操作。為分析液滴中病毒感染細(xì)胞事件,對(duì)液滴中的病毒RNA分子進(jìn)行基因擴(kuò)增,搭建微流控液滴的熒光信號(hào)檢測(cè)平臺(tái),通過檢測(cè)有/無熒光信號(hào)液滴的數(shù)量,計(jì)算了樣品溶液中病毒的滴度(PFU/m L)。通過分析病毒裂解量Bs和病毒基因組數(shù)量與病毒空斑形成單位數(shù)量之間的比例Rg,對(duì)復(fù)合液滴微流控系統(tǒng)功能進(jìn)行優(yōu)化。利用液滴微流控的病毒滴度分析平臺(tái),實(shí)現(xiàn)抗體的中和效率測(cè)試,并與傳統(tǒng)方法進(jìn)行對(duì)比分析,說明復(fù)合液滴微流控系統(tǒng)的優(yōu)越性。重組病毒的產(chǎn)生頻率非常稀少卻具有產(chǎn)生高風(fēng)險(xiǎn)、高致病率病毒變異株的風(fēng)險(xiǎn),因此在大通量樣本中分選低拷貝數(shù)重組病毒并進(jìn)行定量檢測(cè)是生物學(xué)研究的技術(shù)瓶頸。搭建了具有分選功能的復(fù)合液滴微流控系統(tǒng),對(duì)病毒溶液中單個(gè)重組病毒進(jìn)行包裹和差異化PCR進(jìn)行擴(kuò)增,設(shè)計(jì)并驗(yàn)證了基于重組病毒的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系。依托高通量的液滴的檢測(cè)和分選平臺(tái),對(duì)液滴中的重組病毒進(jìn)行檢測(cè)、計(jì)數(shù)、分選操作,液滴的分選頻率可高達(dá)800個(gè)/秒。結(jié)合液滴的檢測(cè)、分選和基因測(cè)序技術(shù),確定了病毒重組發(fā)生的頻率和發(fā)生在基因片段上的準(zhǔn)確位置。通過高通量液滴微流控檢測(cè)平臺(tái),解決了現(xiàn)有的重組病毒檢測(cè)方法無法有效區(qū)分真實(shí)病毒重組現(xiàn)象和人工重組產(chǎn)物的問題,實(shí)現(xiàn)了液滴微流控技術(shù)對(duì)低拷貝數(shù)重組病毒的精準(zhǔn)分析。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R373

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本文編號(hào)：1472925