本文關鍵詞： 液滴微流控 熒光檢測 介電泳分選 高通量 病毒顆粒　出處：《哈爾濱工業(yè)大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：病毒是自然界中數(shù)量最多的微生物,它導致的大規(guī)模傳染性疾病如SARS、埃博拉等,給人類的生命財產(chǎn)安全帶來巨大損失。病毒性疾病之所以傳播迅速,究其原因是其變異速度極快,同時傳統(tǒng)的醫(yī)學檢測方法對其檢測效率較低所致。因此,如何快速、準確的對病毒進行定量檢測與分選是現(xiàn)代生物學研究的緊迫問題。液滴微流控技術以其高通量、速度快的特征已成為近年來微流控技術的主流科研熱點,它在生物顆粒的精確定量與快速檢測方面獨具優(yōu)勢�；诖�,本文以液滴微流控技術為出發(fā)點,面向生物顆粒的高通量、快速檢測等關鍵科學技術問題開展研究,以期實現(xiàn)對病毒等生物樣品的精準檢測,為疾病的早期診斷、快速治療等提供理論依據(jù)與技術支撐。本文首先以微納尺度流體流動的視角出發(fā),分析了微通道內兩相流的基本理論,提出了綜合利用液滴及介電泳技術實現(xiàn)高通量顆粒檢測與分選的新方法;給出了液滴的生成、運動及電場操縱顆粒的控制方程,并分別建立了相應的仿真模型,數(shù)值模擬了液滴生成規(guī)律及分選的結構設置原則。為驗證理論研究的正確性,對液滴的生成、檢測與分選進行了實驗研究,為后續(xù)應用研究奠定理論基礎。為能夠在大量不具有突變RNA的病毒樣本中,快速定位并準確定量檢測突變RNA病毒,進而遏制病毒性傳染病的變異與傳播,本文將液滴微流控技術的高通量特性應用于RNA病毒定量檢測中。以直徑為30 nm的鼠類諾瓦克病毒株MNV-1為研究對象,搭建基礎高通量液滴微流控系統(tǒng),實現(xiàn)單個病毒RNA分子的精確包裹。根據(jù)泊松分布原理,準確稀釋病毒樣品使得每個液滴中的病毒RNA模板數(shù)量不超過1個。依托該系統(tǒng),實現(xiàn)1000個/秒的高通量液滴生成速度,同時控制液滴直徑精確為25μm,體積為12.5 p L。在單個液滴中實現(xiàn)了一步法逆轉錄的PCR擴增,并搭建了高通量液滴的熒光信號檢測平臺,通過檢測分析統(tǒng)計了有(N+)/無(N-)熒光的液滴數(shù)量,進而計算了樣品溶液中病毒的濃度(基因組/m L)。實驗研究驗證了液滴微流控系統(tǒng)進行定量分析的高靈敏度、高通量特性。在病毒定量檢測的基礎上,準確檢測其感染特性是阻斷其生命進程的核心步驟,而這一步驟則需要在基礎液滴微流控系統(tǒng)中合理耦合加樣、混合等功能。搭建了具有在液滴中進行取樣和注入功能的復合液滴微流控系統(tǒng),提出了一種不依托細胞培養(yǎng)的、可快速及時檢測病毒滴度的新方法。通過該系統(tǒng)同時包裹了具有感染力的病毒顆粒和宿主細胞,生成了大量的、尺寸均勻的微尺度液滴,并對孵育后的液滴微反應器進行病毒RNA分子取樣和RT-PCR試劑注入操作。為分析液滴中病毒感染細胞事件,對液滴中的病毒RNA分子進行基因擴增,搭建微流控液滴的熒光信號檢測平臺,通過檢測有/無熒光信號液滴的數(shù)量,計算了樣品溶液中病毒的滴度(PFU/m L)。通過分析病毒裂解量Bs和病毒基因組數(shù)量與病毒空斑形成單位數(shù)量之間的比例Rg,對復合液滴微流控系統(tǒng)功能進行優(yōu)化。利用液滴微流控的病毒滴度分析平臺,實現(xiàn)抗體的中和效率測試,并與傳統(tǒng)方法進行對比分析,說明復合液滴微流控系統(tǒng)的優(yōu)越性。重組病毒的產(chǎn)生頻率非常稀少卻具有產(chǎn)生高風險、高致病率病毒變異株的風險,因此在大通量樣本中分選低拷貝數(shù)重組病毒并進行定量檢測是生物學研究的技術瓶頸。搭建了具有分選功能的復合液滴微流控系統(tǒng),對病毒溶液中單個重組病毒進行包裹和差異化PCR進行擴增,設計并驗證了基于重組病毒的PCR擴增反應體系。依托高通量的液滴的檢測和分選平臺,對液滴中的重組病毒進行檢測、計數(shù)、分選操作,液滴的分選頻率可高達800個/秒。結合液滴的檢測、分選和基因測序技術,確定了病毒重組發(fā)生的頻率和發(fā)生在基因片段上的準確位置。通過高通量液滴微流控檢測平臺,解決了現(xiàn)有的重組病毒檢測方法無法有效區(qū)分真實病毒重組現(xiàn)象和人工重組產(chǎn)物的問題,實現(xiàn)了液滴微流控技術對低拷貝數(shù)重組病毒的精準分析。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R373

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本文編號：1472925