本文關(guān)鍵詞：水貂阿留申病毒的分離鑒定和五種核酸疫苗的構(gòu)建及免疫原性研究　出處：《吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：水貂阿留申病(Aleutian disease,AD),是由水貂阿留申病毒(Aleutian disease virus,ADV)引起的水貂免疫系統(tǒng)紊亂,同時(shí)并發(fā)自身免疫系統(tǒng)混亂的一種慢性、傳染性病毒疾病,又稱為漿細(xì)胞增多癥。水貂阿留申病因其獨(dú)特的致病機(jī)理和免疫機(jī)理,造成水貂阿留申病的免疫預(yù)防成為世界性的難題,至今尚未研制出有效的疫苗,給水貂養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為此,本研究在對(duì)我國水貂阿留申病毒流行株分離鑒定的基礎(chǔ)上,對(duì)分離毒株進(jìn)行全基因組測序分析;篩選候選毒株,對(duì)其關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變,構(gòu)建全基因突變核酸疫苗;在實(shí)驗(yàn)室前期工作的基礎(chǔ)上,構(gòu)建ADV NS1全長基因、ADV NS1截短基因、ADV VP2全長基因和ADV VP2截短基因四種核酸疫苗;將構(gòu)建的五種核酸疫苗免疫小鼠和本動(dòng)物水貂,系統(tǒng)的監(jiān)測所構(gòu)建核酸疫苗的免疫原性,并分析ADV NS1全長基因核酸疫苗與ADV VP2全長基因核酸疫苗相互作用免疫效果。本論文將為破解水貂阿留申病尚無有效防制疫苗的難題,做出有益的探索。對(duì)采自我國疑似阿留申病而死的水貂內(nèi)臟進(jìn)行病毒分離,通過PCR鑒定及動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn),確定共獲得5株水貂阿留申病毒分離株,分別命名為ADV-DL124、ADV-DL125、ADV-JL3、ADV-QD2和ADV-QD3;應(yīng)用免疫過氧化物酶單層細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)所分離的ADV進(jìn)行檢測及TCID50測定。結(jié)果表明:ADV-DL124、ADV-DL125、ADV-JL3、ADV-QD2和ADV-QD3的TCID50分別為105.7 TCID50/ml、105.0 TCID50/ml、104.6 TCID50/ml、105.2TCID50/ml和104.1 TCID50/ml;根據(jù)Genbank上公布的不同ADV毒株基因序列,設(shè)計(jì)并合成12對(duì)引物,對(duì)所分離的病毒進(jìn)行全基因擴(kuò)增和測序。結(jié)果表明:ADV-DL124、ADV-DL125、ADV-JL3、ADV-QD2和ADV-QD3的基因組全長分別為4476bp、4538bp、4572bp、4569bp和4566bp;將分離毒株與ADV參考毒株以及細(xì)小病毒亞科各屬代表種的全基因序列進(jìn)行核苷酸序列分析及同源性比較。結(jié)果表明:ADV-QD3株與ADV-SL3株同源性最低,為92.8%。ADV-JL3株與ADV-U株同源性最高,為96.8%。對(duì)病毒分離鑒定和動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行綜合分析,選取毒力較強(qiáng)的ADV-DL125株為候選毒株;應(yīng)用重疊延伸PCR技術(shù),定點(diǎn)突變ADV-DL125株VP2基因352、395和534位點(diǎn)的氨基酸,構(gòu)建全基因突變核酸疫苗pcDNA3.1-ADV;同時(shí),構(gòu)建ADV NS1全長基因、ADV NS1截短基因、ADV VP2全長基因和ADV VP2截短基因四種核酸疫苗;通過間接免疫熒光及Western-blot實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的五種核酸疫苗具有良好的反應(yīng)原性;將構(gòu)建的五種核酸疫苗免疫小鼠,通過檢測小鼠體液免疫水平和細(xì)胞免疫水平的變化,表明構(gòu)建的五種核酸疫苗能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生顯著體液免疫反應(yīng),同時(shí)能夠增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。將構(gòu)建的五種核酸疫苗及pcDNA3.1-NS1與pcDNA3.1-VP2核酸疫苗相互作用免疫水貂,并在ADV攻毒后,每隔14天監(jiān)測水貂血清中γ球蛋白含量及外周血淋巴細(xì)胞中CD8+細(xì)胞含量。結(jié)果表明:與PBS空白對(duì)照組相比,構(gòu)建的核酸疫苗pcDNA3.1-ADV及pcDNA3.1-VP2+NS1免疫后的水貂,能夠引起機(jī)體產(chǎn)生ADV抗體,且外周血淋巴細(xì)胞中CD8+細(xì)胞含量較低。在ADV感染機(jī)體后,該兩組血清中γ球蛋白及抗原抗體復(fù)合物的含量相較于其他各個(gè)實(shí)驗(yàn)組最低,表現(xiàn)出了良好的疫苗潛質(zhì)。
[Abstract]:On the basis of isolation and identification of mink Aleutian disease virus ( Aleutian disease , AD ) , four kinds of nucleic acid vaccines of mink Aleutian disease virus were identified . The nucleotide sequence analysis and homology comparison of five kinds of nucleic acid vaccines were carried out . The results showed that the whole length of the genomic DNA vaccine was 4476bp , 4538bp , 4572bp , 4569bp and 4566bp .

【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

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1 郭全海;劉秀玲;;免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)檢測豬圓環(huán)病毒2型方法的建立[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2012年11期

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本文編號(hào)：1403224