發(fā)布時間：2018-01-10 01:05

  本文關鍵詞：水貂阿留申病毒的分離鑒定和五種核酸疫苗的構建及免疫原性研究　出處：《吉林農(nóng)業(yè)大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：水貂阿留申病(Aleutian disease,AD),是由水貂阿留申病毒(Aleutian disease virus,ADV)引起的水貂免疫系統(tǒng)紊亂,同時并發(fā)自身免疫系統(tǒng)混亂的一種慢性、傳染性病毒疾病,又稱為漿細胞增多癥。水貂阿留申病因其獨特的致病機理和免疫機理,造成水貂阿留申病的免疫預防成為世界性的難題,至今尚未研制出有效的疫苗,給水貂養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。為此,本研究在對我國水貂阿留申病毒流行株分離鑒定的基礎上,對分離毒株進行全基因組測序分析;篩選候選毒株,對其關鍵位點進行定點突變,構建全基因突變核酸疫苗;在實驗室前期工作的基礎上,構建ADV NS1全長基因、ADV NS1截短基因、ADV VP2全長基因和ADV VP2截短基因四種核酸疫苗;將構建的五種核酸疫苗免疫小鼠和本動物水貂,系統(tǒng)的監(jiān)測所構建核酸疫苗的免疫原性,并分析ADV NS1全長基因核酸疫苗與ADV VP2全長基因核酸疫苗相互作用免疫效果。本論文將為破解水貂阿留申病尚無有效防制疫苗的難題,做出有益的探索。對采自我國疑似阿留申病而死的水貂內(nèi)臟進行病毒分離,通過PCR鑒定及動物回歸實驗,確定共獲得5株水貂阿留申病毒分離株,分別命名為ADV-DL124、ADV-DL125、ADV-JL3、ADV-QD2和ADV-QD3;應用免疫過氧化物酶單層細胞實驗對所分離的ADV進行檢測及TCID50測定。結(jié)果表明:ADV-DL124、ADV-DL125、ADV-JL3、ADV-QD2和ADV-QD3的TCID50分別為105.7 TCID50/ml、105.0 TCID50/ml、104.6 TCID50/ml、105.2TCID50/ml和104.1 TCID50/ml;根據(jù)Genbank上公布的不同ADV毒株基因序列,設計并合成12對引物,對所分離的病毒進行全基因擴增和測序。結(jié)果表明:ADV-DL124、ADV-DL125、ADV-JL3、ADV-QD2和ADV-QD3的基因組全長分別為4476bp、4538bp、4572bp、4569bp和4566bp;將分離毒株與ADV參考毒株以及細小病毒亞科各屬代表種的全基因序列進行核苷酸序列分析及同源性比較。結(jié)果表明:ADV-QD3株與ADV-SL3株同源性最低,為92.8%。ADV-JL3株與ADV-U株同源性最高,為96.8%。對病毒分離鑒定和動物回歸實驗的結(jié)果進行綜合分析,選取毒力較強的ADV-DL125株為候選毒株;應用重疊延伸PCR技術,定點突變ADV-DL125株VP2基因352、395和534位點的氨基酸,構建全基因突變核酸疫苗pcDNA3.1-ADV;同時,構建ADV NS1全長基因、ADV NS1截短基因、ADV VP2全長基因和ADV VP2截短基因四種核酸疫苗;通過間接免疫熒光及Western-blot實驗,驗證本實驗所構建的五種核酸疫苗具有良好的反應原性;將構建的五種核酸疫苗免疫小鼠,通過檢測小鼠體液免疫水平和細胞免疫水平的變化,表明構建的五種核酸疫苗能夠刺激機體產(chǎn)生顯著體液免疫反應,同時能夠增強機體的細胞免疫應答水平。將構建的五種核酸疫苗及pcDNA3.1-NS1與pcDNA3.1-VP2核酸疫苗相互作用免疫水貂,并在ADV攻毒后,每隔14天監(jiān)測水貂血清中γ球蛋白含量及外周血淋巴細胞中CD8+細胞含量。結(jié)果表明:與PBS空白對照組相比,構建的核酸疫苗pcDNA3.1-ADV及pcDNA3.1-VP2+NS1免疫后的水貂,能夠引起機體產(chǎn)生ADV抗體,且外周血淋巴細胞中CD8+細胞含量較低。在ADV感染機體后,該兩組血清中γ球蛋白及抗原抗體復合物的含量相較于其他各個實驗組最低,表現(xiàn)出了良好的疫苗潛質(zhì)。
[Abstract]:On the basis of isolation and identification of mink Aleutian disease virus ( Aleutian disease , AD ) , four kinds of nucleic acid vaccines of mink Aleutian disease virus were identified . The nucleotide sequence analysis and homology comparison of five kinds of nucleic acid vaccines were carried out . The results showed that the whole length of the genomic DNA vaccine was 4476bp , 4538bp , 4572bp , 4569bp and 4566bp .

【學位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65

【參考文獻】

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1 郭全海;劉秀玲;;免疫過氧化物酶單層細胞試驗檢測豬圓環(huán)病毒2型方法的建立[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2012年11期

2 王克祥;劉永逵;孫宏磊;;水貂阿留申病的研究進展[J];中國畜牧獸醫(yī);2010年12期

3 劉長明;張超范;危艷武;張朝霞;袁婧;;豬圓環(huán)病毒2型免疫過氧化物酶單層細胞試驗抗體檢測試劑盒的研制及應用[J];中國預防獸醫(yī)學報;2007年08期

4 朱善元;王健;;水貂阿留申病基因檢測芯片的研究與初步應用[J];中國預防獸醫(yī)學報;2006年06期

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本文編號：1403224