發(fā)布時間：2018-01-10 05:06

  本文關鍵詞：FAK對不同分化狀態(tài)的神經(jīng)干細胞定向遷移的調(diào)控研究　出處：《蘇州大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： 神經(jīng)干細胞(NSCs) 分化 VEGF 定向遷移 FAK PI3K/Akt MAPKs Rac1

【摘要】：神經(jīng)干/祖細胞(Neural stem/progenitor cells,NSCs)的遷移對哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和損傷修復至關重要。許多神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生是由于NSCs遷移缺陷導致的,所以激發(fā)內(nèi)源或外源移植的NSCs向神經(jīng)損傷部位的遷移,是治療神經(jīng)性疾病的關鍵因素。我們的前期研究已表明,血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)誘導的NSCs趨化遷移與其分化狀態(tài)、粘著斑(focal adhesion,FA)動態(tài)變化及肌動蛋白(F-actin)細胞骨架重塑相關。粘著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)作為胞質酪氨酸激酶,在生長因子介導的信號通路及細胞遷移過程中起著關鍵作用,然而其在NSCs的趨化遷移過程中的作用還未被知詳。本實驗研究將探討在不同分化狀態(tài)的NSCs趨向VEGF的遷移過程中,FAK對FA的動態(tài)變化和分布的調(diào)控作用,及其與PI3K/Akt、MAPKs和Rac1信號通路之間的相互調(diào)節(jié)機制。利用C17.2 NSCs進行趨化遷移實驗發(fā)現(xiàn),PF573228(FAK抑制劑,簡稱PF-228)抑制FAK活性后,顯著抑制了VEGF誘導的不同分化狀態(tài)的細胞趨化遷移:Boyden chamber群體細胞遷移實驗,未分化、分化1 d和分化3 d的NSCs的遷移數(shù)量均減少;Dunn chamber單細胞趨化遷移實驗,未分化和分化1 d的NSCs向VEGF的趨化遷移明顯受抑,細胞的遷移速度降低,遷移持續(xù)性也下降。另外,PF-228顯著抑制VEGF誘導的胎鼠大腦皮層神經(jīng)球和大鼠SVZ神經(jīng)球的鋪展及遷移,神經(jīng)球的鋪展半徑減小,細胞遷移的速度也降低。FA在細胞遷移過程中呈不斷形成-解聚的動態(tài)周轉狀態(tài),FAK可以通過影響FA的形成及動態(tài)組裝從而調(diào)控細胞遷移。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn),細胞在VEGF誘導下易伸出偽足,胞內(nèi)的微絲結構發(fā)生重塑。許多小斑點樣的FA在片狀偽足處形成,FA的總數(shù)量增加。而在PF-228作用下,FA總數(shù)量減少,新生FA比例下降,成熟FA比例增加,說明不僅FA的形成受到抑制,而且成熟FA的解聚也受阻。并且在PF-228作用下,VEGF促進的p Y397-FAK和p Y31/p Y118-paxillin的磷酸化作用顯著下調(diào)。細胞遷移至劃痕區(qū)域過程中,VEGF誘導的新生FA主要分布在鋪展的片狀偽足處,前后FA極性分布比例較大,而PF-228處理后,成熟穩(wěn)定的FA僅局限分布在細胞邊緣。相應的,活細胞跟蹤觀察FA動態(tài)變化發(fā)現(xiàn),VEGF顯著提高了FA的周轉速度,FA的組裝加快,在細胞遷移前端不斷形成小斑點FA,細胞尾端的FA也快速解聚;而PF-228作用下,細胞周邊的FA斑點較大,周轉緩慢,細胞尾端的FA解聚也較慢。轉染FAK活性突變體發(fā)現(xiàn),p RKGFP-FAK能夠響應VEGF的刺激,FA數(shù)量變多,長度變短,而FAK-Y397F失活型指示的FA顯著長于p RKGFP-FAK指示的FA,并且不響應VEGF的刺激,FA沒有變化。說明FAK的Y397位點的活化在FA動態(tài)變化中起著關鍵作用。PF-228抑制FAK活性后,不同程度的抑制了PI3K/Akt和MAPKs信號通路的下游分子,包括Akt、ERK1/2、SAPK/JNK和p38MAPK的磷酸化作用,所以FAK影響細胞遷移及FA形成可能與PI3K和MAPKs信號轉導通路有關:抑制PI3K/Akt或MAPKs信號通路,不同程度的阻礙了大鼠SVZ神經(jīng)球的遷移及VEGF誘導的細胞遷移,特別是ERK1/2和SAPK/JNK信號通路顯著長效的抑制了神經(jīng)球的鋪展;不同分化狀態(tài)的FA形成也受到不同程度的抑制;劃痕遷移過程中,細胞不具明顯的極性形態(tài),細胞前后端FA的極性分布比例也降低;Western blot也發(fā)現(xiàn),VEGF誘導的FAK和Y31/118-paxillin的磷酸化也減弱,說明在細胞遷移及FA動態(tài)周轉過程中,FAK與PI3K/Akt和MAPKs通路之間可能是相互調(diào)節(jié)的作用機制。最后,我們檢測了調(diào)控F-actin細胞骨架的Rac1-GTPase在VEGF誘導的細胞遷移和FA形成中的作用。過表達Rac1激活型突變體Rac1-Q61L和Rac1-G12V,細胞趨化遷移的效率顯著升高,片狀偽足的伸展具有方向持續(xù)性,并且FA的數(shù)量顯著增多。而轉染Rac1顯性陰性突變體Rac1-T17N,FA的數(shù)量較少,說明活化的Rac1促進FA形成,失活的Rac1抑制FA形成。在VEGF刺激下,p IRES2-GFP對照細胞和Rac1野生型細胞中的FA增加,而Rac1-Q61L和Rac1-G12V的細胞中的FA數(shù)量沒有進一步增多,Rac1-T17N的細胞也不響應VEGF的刺激,說明VEGF誘導的FA形成過程中需要Rac1的活化。另外,FAK抑制劑作用下,無論是Rac1野生型還是Rac1激活型細胞中的FA形成均受到抑制,說明Rac1參與調(diào)控FA的形成最終還是需要通過FAK的活化。綜上所述,通過本實驗研究,我們明確了FAK在不同分化狀態(tài)的細胞遷移中的作用,弄清了FAK對FA動態(tài)周轉的調(diào)控機制,及其在此過程中與PI3K/Akt、MAPKs和Rac1信號通路相互作用的機制,為更好的調(diào)控細胞遷移提供有力的證據(jù)。
[Abstract]:The migration of neural stem / progenitor cells in the neural stem / progenitor cells is very important for the development and repair of the nervous system in mammals . At the same time , there was a significant increase in the phosphorylation of FA at the front and back of the cells . The effect of PF - 228 on the migration of VEGF and the phosphorylation of p38MAPK were observed . In the presence of VEGF , the number of FA in Rac1 - GFP - control cells and Rac1 - G12V cells was inhibited . The mechanism of the interaction between Rac1 - Q61L and Rac1 - G12V was demonstrated .

【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R329.2

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本文編號：1403940