本文關(guān)鍵詞：鯉鈣蛋白酶基因家族克隆表達(dá)及與肌肉質(zhì)構(gòu)相關(guān)性研究　出處：《哈爾濱工業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：鈣蛋白酶家族是與肉質(zhì)科學(xué)相關(guān)最廣泛的蛋白質(zhì)水解酶之一,該酶是導(dǎo)致肌肉蛋白質(zhì)水解,引起肉類嫩度改變的關(guān)鍵酶。鈣蛋白酶家族是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控蛋白家族。鈣蛋白酶(calpain,CAPN)和鈣蛋白酶抑制蛋白(calpastatin,CAST)基因已被作為影響肉嫩度的候選基因,應(yīng)用在動(dòng)物育種、養(yǎng)殖以及動(dòng)物屠宰后肉產(chǎn)品的嫩度的鑒定和嫩化等生產(chǎn)中。關(guān)于鯉capn基因家族與肌肉嫩度之間的關(guān)系尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究采用同源克隆法對(duì)鯉CAPN家族主要基因進(jìn)行克隆并進(jìn)行生物信息學(xué)分析,應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)capn基因家族在組織、胚胎和成魚肌肉內(nèi)的表達(dá)量及與肉質(zhì)性狀進(jìn)行相關(guān)分析,明確了capn基因家族同生長(zhǎng)及肉質(zhì)性狀間的關(guān)系,為進(jìn)一步通過(guò)該基因家族開發(fā)已知功能的分子標(biāo)記,加快鯉肉質(zhì)優(yōu)良新品種的選育進(jìn)度提供理論支持,為該基因家族的表達(dá)調(diào)控指明方向。采用同源克隆法獲得了鯉capn1、capn2a、capn2b、capn3和cast基因完整的c DNA序列,其在Genbank登錄號(hào)分別為KP878555、KF669387、KF669386、KF669385和JX275386。鯉capn2a和capn2b基因同斑馬魚capn2基因間同源性達(dá)到90%和85%。鯉和斑馬魚capn3基因間同源性達(dá)到89%,而魚類的這兩個(gè)分枝間的同源性為69%。鯉和草魚cast基因氨基酸序列同源性為88%。capn基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹上所顯示的親緣關(guān)系也與傳統(tǒng)的分類學(xué)較為一致。利用在線蛋白質(zhì)特性分析軟件分析了鯉CAPN蛋白家族,分析結(jié)果表明CAPN蛋白家族為親水性蛋白,存在跨膜區(qū),是潛在的跨膜蛋白。CAPN蛋白家族不含有信號(hào)肽序列,CAPN1蛋白亞細(xì)胞定位于線粒體,CAPN2和CAPN3蛋白的亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì),CAST蛋白定位于細(xì)胞核。CAPN蛋白家族均含有磷酸化位點(diǎn),CAPN1蛋白P52和CAPN3蛋白D627屬于不常見(jiàn)磷酸化位點(diǎn)。CAPN蛋白均存在N-連接糖基化位點(diǎn)而無(wú)O連接糖基化位點(diǎn)。CAST蛋白含有1個(gè)N-連接糖基化位點(diǎn)和36個(gè)O-連接糖基化位點(diǎn)。由于糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)時(shí)未發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽特征,36個(gè)潛在的O-糖基化位點(diǎn)并不能進(jìn)行糖基化。利用在線蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件對(duì)鯉CAPN蛋白家族結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明,CAPN蛋白家族含有3種二級(jí)結(jié)構(gòu),包括α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈。鯉CAPN蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)為不規(guī)則球狀結(jié)構(gòu),各蛋白在結(jié)構(gòu)域I上有區(qū)別。鯉CAST蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)為鏈狀結(jié)構(gòu)。鯉CAPN蛋白具有典型四個(gè)結(jié)構(gòu)域,但CAPN3蛋白不含有3個(gè)典型的插入?yún)^(qū)域。CAST蛋白酶含有4個(gè)重復(fù)保守結(jié)構(gòu)域,結(jié)構(gòu)域之間的一致性達(dá)到44.02%。利用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)capn基因家族進(jìn)行的定量分析發(fā)現(xiàn),capn基因家族在鯉8種組織中都有表達(dá),各組織中的表達(dá)量因組織不同存在較大差異,含肌纖維組織內(nèi)的表達(dá)量相對(duì)較高。在鯉囊胚期、體節(jié)期、咽胚期、出膜期和攝食期均有表達(dá),但其時(shí)序表達(dá)量差異明顯,鯉胚胎期capn3和cast呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。capn基因家族在肌肉內(nèi)的表達(dá)量存在相關(guān),cast基因?qū)apn基因的抑制作用最明顯的是capn1基因,而對(duì)capn2和capn3的作用不明顯。capn1基因與鯉體重、體寬和水分含量呈正相關(guān),且與水分之間為顯著正相關(guān)。capn3基因與灰分會(huì)呈正相關(guān)關(guān)系。cast基因與蛋白質(zhì)和脂肪含量為正相關(guān),與其他指標(biāo)均為負(fù)相關(guān)。通過(guò)提取獲得的CAPN蛋白家族的量與熒光定量PCR檢測(cè)得到的該蛋白家族的相對(duì)表達(dá)量變化趨勢(shì)基本一致,CAPN3和CAST蛋白的表達(dá)量顯著高于CAPN1和CAPN2蛋白。利用物性測(cè)試儀檢測(cè)鯉肌肉質(zhì)構(gòu)發(fā)現(xiàn),冷凍能夠大大延緩魚類肌肉品質(zhì)的改變,且溫度越低品質(zhì)下降越慢,-80℃凍藏鯉肌肉質(zhì)構(gòu)要略高于-20℃。水分與粘附性顯著正相關(guān),體重與黏聚性、膠黏性和咀嚼度顯著正相關(guān),體寬與咀嚼度顯著正相關(guān),蛋白質(zhì)與肌肉恢復(fù)力顯著正相關(guān)。capn基因家族與肌肉質(zhì)構(gòu)存在相關(guān)性,除了capn2b與黏聚性為顯著負(fù)相關(guān)外,capn1與黏附性、capn2a與恢復(fù)性、capn2b與硬度、capn3與咀嚼度以及cast與黏聚性均呈現(xiàn)出強(qiáng)相關(guān)性。因此,鯉capn基因家族可作為肉質(zhì)嫩度性狀的候選基因。為進(jìn)一步改善鯉肌肉品質(zhì),可以應(yīng)用capn基因家族的基因序列開發(fā)SNP分子標(biāo)記,進(jìn)行肉質(zhì)優(yōu)良鯉新品種選育。同時(shí),也可以調(diào)控capn基因家族的表達(dá),降低CAPN蛋白的水解作用和CAST蛋白抑制作用,達(dá)到促生長(zhǎng)和改善肌肉品質(zhì)的目的。
[Abstract]:Calpain ( CAPN ) and calpastatin ( CAST ) gene have been cloned and analyzed by homologous clone method . The sequence of capn2a , capn2a , capn2b , capn2a and capn2b gene has been cloned and analyzed . The expression of capn gene family is positively correlated with the content of capn2b and capn2a . The results show that the capn gene family has positive correlation with the content of protein and fat .

【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S917.4;Q78

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本文編號(hào)：1402983