本文關(guān)鍵詞：芳香族氨基酸羥化酶及單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在日本刺沙蠶（Neanthes japonica）中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分化研究　出處：《東北師范大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：本研究以低等無(wú)脊椎環(huán)節(jié)動(dòng)物門的典型模式動(dòng)物——日本刺沙蠶Neanthes japonica為研究對(duì)象,采用本實(shí)驗(yàn)室CP(Colophony Paraffin)包埋切片專利技術(shù)結(jié)合免疫組織化學(xué)技術(shù)(SP法)及cDNA末端快速克隆(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技術(shù),闡述了芳香族氨基酸羥化酶(aromatic amino acid hydroxylase,AAAHs)家族中三種羥化酶即色氨酸羥化酶(tryptophan hydroxylase,TPH)、苯丙氨酸羥化酶(phenylalanine hydroxylase,PAH)和酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH),以及多巴胺β羥化酶(dopamine-beta-hydroxylase,DβH)、苯乙醇胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶(phenylethanolamine-N-methyltransferase,PNMT)在其中樞神經(jīng)系統(tǒng)(主要是腦)內(nèi)的表達(dá)和分布情況,對(duì)芳香族氨酸羥化酶與單胺類神經(jīng)遞質(zhì)之間的關(guān)系進(jìn)行了分析與討論,并分析與探討芳香族氨基酸羥化酶的基因進(jìn)化節(jié)點(diǎn)問題,獲得以下主要結(jié)論:1.應(yīng)用羊抗TPH多克隆抗體和兔抗5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)抗血清,通過(guò)對(duì)日本刺沙蠶Neanthes japonica大腦和腹神經(jīng)索連續(xù)和相鄰切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,結(jié)果表明5-HT表現(xiàn)出較強(qiáng)的陽(yáng)性免疫反應(yīng),而TPH的陽(yáng)性免疫反應(yīng)較弱。5-HT和TPH的同步陽(yáng)性免疫反應(yīng)體現(xiàn)出廣泛和一致的分布模式,TPH呈免疫陽(yáng)性反應(yīng)神經(jīng)元細(xì)胞的類型、分布和投射與5-HT陽(yáng)性免疫反應(yīng)神經(jīng)元細(xì)胞是相一致的,TPH和5-HT共定位于同一細(xì)胞的相同位置,具有共定位的現(xiàn)象存在。因此,TPH和5-HT互為判定中樞神經(jīng)系統(tǒng)5-HT能神經(jīng)元標(biāo)記物,同時(shí)也從蛋白質(zhì)水平證明了TPH在日本刺沙蠶中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的存在。應(yīng)用RACE克隆技術(shù)對(duì)日本刺沙蠶中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的神經(jīng)型TPH全序列進(jìn)行了克隆,通過(guò)構(gòu)建基因進(jìn)化樹,進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析,證明神經(jīng)型TPH在基因水平的存在,為AAAHs中tph和pah基因分化的節(jié)點(diǎn)由節(jié)肢動(dòng)物門向前推進(jìn)到環(huán)節(jié)動(dòng)物門提供了證據(jù)。2.應(yīng)用鼠抗PAH多克隆抗體,通過(guò)對(duì)日本刺沙蠶Neanthes japonica大腦連續(xù)切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,結(jié)果表明鼠抗PAH多克隆抗體在全腦中均標(biāo)記出大量伴隨長(zhǎng)長(zhǎng)投射發(fā)出的蝌蚪狀神經(jīng)元細(xì)胞,而且在中腦和后腦的中央神經(jīng)區(qū)也布滿了靜脈曲張樣的神經(jīng)纖維,對(duì)以往應(yīng)用兔抗PAH多克隆抗體的標(biāo)記結(jié)果進(jìn)行了很好的補(bǔ)充。該結(jié)果中也推翻了以前根據(jù)兔抗PAH多克隆抗體標(biāo)記結(jié)果所做出的關(guān)于PAH只能在細(xì)胞液中使苯丙氨酸(phenylalanine,Phe)轉(zhuǎn)變?yōu)槔野彼?tyrosine,Tyr),而不需要分泌到胞外遠(yuǎn)端去發(fā)揮作用的假設(shè)。PAH在全腦的分布情況說(shuō)明PAH既可以在神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)催化苯丙氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槔野彼?也可以分泌到遠(yuǎn)端(主要是中腦和后腦的中央神經(jīng)區(qū))去發(fā)揮作用。PAH的免疫組化標(biāo)記結(jié)果說(shuō)明在低等的環(huán)節(jié)動(dòng)物日本刺沙蠶Neanthes japonica體內(nèi)PAH和TPH已經(jīng)各自分化為獨(dú)立基因,有各自獨(dú)立的表達(dá)產(chǎn)物,進(jìn)一步證實(shí)了tph和pah基因分化的節(jié)點(diǎn)可能存在于環(huán)節(jié)動(dòng)物門。3.應(yīng)用兔抗TH多克隆抗體,通過(guò)對(duì)日本刺沙蠶Neanthes japonica大腦連續(xù)切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,結(jié)果表明TH在全腦中均有分布,其分布形式與TPH和5-HT相似,但卻又不完全相同,與PAH在腦內(nèi)的分布特點(diǎn)也不一樣。根據(jù)TH是多巴胺能(Dopaminergic)神經(jīng)元細(xì)胞良好標(biāo)記物的觀點(diǎn),由免疫組織化學(xué)結(jié)果分析可知多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞在全腦的額切片中均有分布,但強(qiáng)陽(yáng)性免疫反應(yīng)多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞相對(duì)較少,而弱陽(yáng)性反應(yīng)多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞偏多。多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞主要分布于背側(cè),胞體大多無(wú)神經(jīng)突,只有少量呈TH免疫陽(yáng)性神經(jīng)元發(fā)出短的陽(yáng)性纖維投射到大腦的中央神經(jīng)區(qū),說(shuō)明酪氨酸主要在多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)被TH所羥化,只有少量的酶被運(yùn)送到近處和中遠(yuǎn)處被用于羥化反應(yīng)。同時(shí)證明在環(huán)節(jié)動(dòng)物日本刺沙蠶體內(nèi)三種AAAHs是各自獨(dú)立存在的,為tph、pah、th基因進(jìn)化節(jié)點(diǎn)問題的分析提供了依據(jù)。4.應(yīng)用兔抗DβH和兔抗PNMT多克隆抗體,通過(guò)對(duì)日本刺沙蠶Neanthes japonica大腦連續(xù)切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,結(jié)果表明DβH在前腦分布細(xì)胞群較多,而中腦和后腦細(xì)胞群相對(duì)分布較少,細(xì)胞胞體大于前腦。但PNMT形成的細(xì)胞群卻相對(duì)少,DβH在細(xì)胞內(nèi)主要分布于細(xì)胞膜上,少量充滿細(xì)胞的胞體,其在細(xì)胞內(nèi)的分布與在高等生物細(xì)胞內(nèi)的兩種存在方式即溶解狀態(tài)和膜結(jié)合狀態(tài)相一致,而PNMT則主要位于細(xì)胞液中,細(xì)胞核中無(wú)分布。從DβH和PNMT這兩種酶的免疫組化標(biāo)記結(jié)果可知,低等無(wú)脊椎環(huán)節(jié)動(dòng)物腦內(nèi)也是存在去甲腎上腺素能和腎上腺素能神經(jīng)元細(xì)胞的,進(jìn)而在腦的不同部位發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。5.綜上可知,單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT和兒茶酚胺(多巴胺、去甲腎上腺素、腎上腺素)在環(huán)節(jié)動(dòng)物日本刺沙蠶體內(nèi)各自獨(dú)立存在,其在體內(nèi)的生成與三種AAAHs的存在是密切相關(guān)的。
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本文編號(hào)：1370594