本文關鍵詞：功能化磁性納米材料的制備及其在蛋白質組學中的應用方法研究　出處：《北京工業(yè)大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： 磷酸肽富集 磁性納米顆粒 金屬有機框架材料 固定化酶反應器 蛋白質組學

【摘要】：隨著生命科學研究飛速發(fā)展和后基因組學時代到來,蛋白質作為生命活動的執(zhí)行體,調節(jié)著生物體內(nèi)諸多重要的生理生化活動。監(jiān)測蛋白質動態(tài)變化、翻譯后修飾狀態(tài)以及研究蛋白質結構功能等對于人們認識生命活動的本質有著極為重要意義。其中,蛋白質磷酸化不僅參與生物體內(nèi)諸多生命活動,還與多種疾病的發(fā)生發(fā)展息息相關。作為蛋白質組學研究的核心技術,生物質譜在磷酸化蛋白質組研究中發(fā)揮著重要作用并得到了廣泛應用。然而,由于生物樣本的復雜性以及在磷酸化蛋白質組分析中存在的大量非磷酸化肽段對磷酸肽質譜分析造成的信號干擾,使磷酸化蛋白質組分析面臨巨大挑戰(zhàn)。此外,在“bottom-up”分析策略中,傳統(tǒng)溶液酶切法耗時長,易發(fā)生酶的自切,極大影響了蛋白質鑒定通量和覆蓋率。因此,發(fā)展快速、高效的蛋白質樣品預處理新方法是提高蛋白質分析靈敏度和鑒定效率的關鍵。本文針對以上問題,(1)發(fā)展了兩種基于新型功能化磁性納米材料的磷酸肽富集分離新方法并成功應用于實際生物樣本,克服了基于固相金屬離子親和色譜法富集磷酸肽特異性差的缺點,并提高了磷酸肽的鑒定效率;(2)制備了一種基于磁性金屬有機框架(metal-organic frameworks,MOFs)材料的新型固定化酶反應器,顯著提高了蛋白質酶切效率并成功應用到小鼠卵母細胞蛋白樣本的快速高效酶切。本論文中,首先闡述了不同材料在蛋白質組學樣品前處理過程中的國內(nèi)外研究現(xiàn)狀,包括功能化磁性納米材料用于磷酸肽的快速富集和固定化酶反應器,以及金屬有機框架材料的研究進展與應用等。其次,基于鑭系金屬表面電子云分布及其與磷酸根可產(chǎn)生相互作用的特征設計合成了一種混合鑭系金屬(Tb~(3+),Tm~(3+),Ho~(3+),Lu~(3+))固載的新型功能化磁性納米材料,Fe_3O_4@TCPP-DOTA-M~(3+),并將其應用于磷酸肽的快速、特異性富集。材料合成中,TCPP(tetrakis(4-carboxylphenyl)porphyrin)的應用不僅可以提高DOTA和鑭系金屬離子的負載量進而增加材料與磷酸肽的碰撞幾率,同時也可以提高磁性納米材料的親水性從而獲得更高的磷酸肽富集效率。另外,大環(huán)配合物DOTA(1,4,7,10-tetraazacyclododecane N,N’,N’’,N’’’-tetraacetic acid)可與鑭系金屬螯合形成熱穩(wěn)定性極高的金屬復合物,進一步增強材料的整體穩(wěn)定性。實驗結果表明,當5 pmolα-酪蛋白酶切產(chǎn)物經(jīng)新材料富集分離后可鑒定19條磷酸肽。即使在100倍(摩爾比)BSA蛋白酶切產(chǎn)物干擾下,經(jīng)新材料富集分離后仍可鑒定到16條磷酸肽,其特異性明顯優(yōu)于商品化的TiO2材料的富集鑒定結果。該新型功能化磁性納米材料進一步應用于HeLa細胞蛋白提取樣品的磷酸肽富集。在單次質譜鑒定后,可成功檢測到9048條磷酸化肽段對應2103個磷酸化蛋白質組。另外,為了系統(tǒng)分析不同金屬離子與磷酸根相互作用行為差異,設計合成了不同金屬離子(Ti~(4+),Zr~(4+),Fe~(3+),Tb~(3+),Tm~(3+),Ho~(3+))固載的新型功能化磁性納米材料,Fe_3O_4@TCPP-DOTA-Ms,并成功應用于多位點磷酸化肽段特異性富集。實驗結果表明,Fe_3O_4@TCPP-DOTA-Tb,Ti富集磷酸肽效果明顯優(yōu)于其他金屬離子固載的材料,并且在鑒定到的磷酸肽中多位點磷酸化肽段的比例也較高。實驗結果進一步證明,固載過渡金屬的磁性納米材料富集磷酸肽的靈敏度優(yōu)于固載鑭系金屬的材料,而固載鑭系金屬的磁性納米材料富集磷酸肽的選擇性優(yōu)于固載過渡金屬的材料。結合過渡金屬和鑭系金屬的優(yōu)勢,采取Fe_3O_4@TCPP-DOTA-Tb/Ti聯(lián)合富集的策略,在HeLa細胞中成功鑒定到了13450條磷酸肽對應2965個磷酸化蛋白質組,富集特異性高達94%。其中,多位點磷酸化肽段占總磷酸肽的比例超過了50%,結果明顯優(yōu)于DHB/TiO2的富集鑒定方法(13.39%)。最后,由于固定化酶反應器可極大縮短蛋白質酶切時間,且MOFs材料具有較大的比表面積和可選擇的作用位點,因此將二者結合制備了一種磁性MOFs材料基固定化酶反應器,Fe_3O_4@DOTA-ZIF-90-trypsin,并成功應用于小鼠卵母細胞蛋白樣本的蛋白質組分析。本工作合成的新型磁性MOFs材料既具有良好的磁響應,又具備MOFs材料比表面積大、結構及熱穩(wěn)定性高等優(yōu)勢。將胰蛋白酶通過與磁性MOFs材料表面的大量醛基共價連接在磁性MOFs材料表面,獲得新型固定化酶反應器。實驗結果表明,BSA蛋白經(jīng)1 min酶切后,獲得了77%的氨基酸序列覆蓋率,其酶切效率優(yōu)于12 h傳統(tǒng)溶液酶切結果(70%)。小鼠卵母細胞蛋白提取樣本經(jīng)20 min酶切后,單次質譜鑒定可檢測到8957條肽段對應1843個蛋白質組。與傳統(tǒng)溶液酶切相比,在酶切后鑒定的肽段和蛋白質組數(shù)目上新方法有67%和40%的提高。本研究不僅發(fā)展了一種磁性MOFs材料快速有效的合成策略,同時也進一步擴大了MOFs材料在蛋白質組學中的應用。
[Abstract]:With the rapid development of life science research and the post genomic era, as the executive body protein of life activity, regulate organism many important physiological activities. The dynamic changes of protein post-translational modification status monitoring, and research in protein structure and function in essential understanding of life activities is of great significance. Among them, protein phosphorylation is not only involved in biological life activities, but also with a variety of diseases is closely related to the development. As the core technology of proteomics research, biological mass spectrometry of proteins plays an important role in the study and is widely used in phosphoric acid. However, due to the complexity of biological samples as well as in the existing phosphorylation proteome analysis in a large number of non phosphopeptide analysis of signal interference caused by the peptide mass of phosphoric acid, the phosphoproteome analysis Facing a huge challenge. In addition, in the "bottom-up" analysis method, the traditional solution of enzyme digestion method is time-consuming and prone to self cutting enzyme, which greatly affects the flux and protein identification coverage. Therefore, the rapid development of the new method, the protein sample pretreatment is the key to improve the efficiency of protein analysis sensitivity and identification efficiency. Aiming at the above problem, (1) the development of two kinds of magnetic nano materials based on the new function of phosphopeptide enrichment and separation method and applied to biological samples, immobilized metal ion affinity chromatography overcomes the shortcomings of the poor enrichment of phosphorus acid peptide specific based on and improve the identification efficiency of phosphopeptides (2;) to prepare a magnetic metal organic framework based on (metal-organic frameworks, MOFs) model of immobilized enzyme reactor materials, significantly increased the protein digestion efficiency and successfully applied to protein mouse oocytes Fast and efficient enzyme sample cut. In this thesis, first elaborated the domestic research status of different materials in the proteomics sample pretreatment process, including functional magnetic nano materials for rapid enrichment and immobilized enzyme reactor phosphopeptide, and the study of metal organic framework materials development and application. Secondly, lanthanide metal surface electron cloud distribution and phosphate can produce a mixture of lanthanide metal synthesis feature design based on interaction (Tb~ (3+), Tm~ (3+), Ho~ (3+), Lu~ (3+)) supported the new functional magnetic nano materials, Fe_3O_4@TCPP-DOTA-M~ (3+). And its application in phosphopeptide enrichment. The rapid, specific materials in the synthesis of TCPP (tetrakis (4-carboxylphenyl) porphyrin) the application can not only improve the loading amount of DOTA and lanthanide metal ions and increase the collision probability of materials and phosphopeptides, at the same time In order to improve the hydrophilicity of magnetic nano materials to obtain higher efficiency of phosphopeptide enrichment. In addition, the macrocyclic complexes of DOTA (1,4,7,10-tetraazacyclododecane N, N ', N', N '' -tetraacetic acid ') and lanthanide metal chelate forming high thermal stability of the metal complex, and further enhance the overall stability of the material the experimental results show that when 5 pmol of alpha casein digestion products by new material enrichment and separation after identification of 19 phosphopeptides. Even in 100 times (molar ratio) BSA protease digestion products by interference, new materials can be identified by the enrichment and separation of 16 phosphopeptide enrichment and identification results, the TiO2 material the opposite sex is obviously better than that of commercialization. The new functionalized magnetic nano material is further applied to HeLa cell protein extraction of phosphopeptide enrichment. Samples in a single mass spectrometry after successfully detected the 9048 phosphopeptides corresponding to 21 03 protein phosphorylation. In addition, in order to analyze the different metal ions and phosphate interaction behavior differences, different metal ions were designed and synthesized (Ti~ (4+), Zr~ (4+), Fe~ (3+), Tb~ (3+), Tm~ (3+), Ho~ (3+)) new function supported the magnetic nano materials, Fe_3O_4@TCPP-DOTA-Ms, and successfully applied to multilocus phosphopeptide specific enrichment. The experimental results show that Fe_3O_4@TCPP-DOTA-Tb, Ti enrichment of phosphopeptides is superior to other metal ion immobilized materials, and to the identification of phosphopeptides in multi site phosphorylated peptide proportion is higher. The experimental results further evidence that the sensitivity is better than solid supported transition metal nanometer magnetic materials for enrichment of phosphopeptides immobilized lanthanide metal materials, the selectivity is better than immobilized lanthanide metal magnetic nano material enrichment of phosphopeptides supported transition metals with transition metal and materials. Take advantage of the lanthanide metal, Fe_3O_4@TCPP-DOTA-Tb/Ti enrichment strategy, identified 13450 phosphopeptides corresponding to 2965 protein phosphorylation in HeLa cells, specific enrichment of up to 94%. the multilocus phosphopeptides total phosphopeptide ratio of more than 50%, the result is better than that of DHB/TiO2 enrichment and identification methods (13.39%). Finally, the immobilized enzyme reactor can greatly shorten the protein digestion time, and MOFs material has larger surface area and alternative sites of action, so a kind of magnetic material based MOFs immobilized enzyme reactor was prepared by the combination of the two Fe_3O_4@DOTA-ZIF-90-trypsin, and proteomic analysis the successful application in mouse oocyte protein samples. In this work, the synthesis of novel magnetic MOFs material has good magnetic response, but also have MOFs large surface area, high thermal stability and structure The advantages of trypsin. With large aldehyde surface magnetic MOFs material connected covalently on the surface of the magnetic material MOFs, novel immobilized enzyme reactor. The experimental results show that the BSA protein was 1 min after enzyme digestion, the amino acid sequence of 77% coverage, the digestion efficiency is superior to the traditional 12 h solution the results of restriction (70%). The protein of mouse oocyte samples were extracted by 20 min enzyme digestion, single mass spectrometry can detect 8957 peptides corresponding to 1843 proteins. Compared with the conventional in solution digestion, digestion identification number of peptides and proteins were new methods and 67% 40% improved. This study not only the development of the synthetic strategy of a magnetic material MOFs quickly and effectively, but also to further expand the MOFs material and its application in proteomics.

【學位授予單位】：北京工業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q51;TB383.1

【相似文獻】

相關期刊論文 前8條

1 操迎梅;;磁性納米材料的發(fā)展及應用[J];安慶師范學院學報(自然科學版);2009年04期

2 張崇琨;陳冬梅;李向遠;楊仕平;;磁性納米材料在磁傳感和生物探針中的應用[J];上海師范大學學報(自然科學版);2012年02期

3 秦淑琪,李錫恩,楊聲,楊武,高錦章;強磁性納米材料磁稀釋體系磁化強度表征的新方法[J];蘭州大學學報;2005年02期

4 劉雯婷;傅芬;許恒毅;范麗娟;;葉酸修飾的磁性納米材料在腫瘤診斷和治療中的應用進展[J];中國組織化學與細胞化學雜志;2014年02期

5 秦淑琪;納鵬軍;李錫恩;楊武;;強磁性納米材料CoFe_2O_4磁稀釋體系磁化強度的表征[J];寧夏大學學報(自然科學版);2006年01期

6 張愛紅;林虹君;;固相萃取材料在蛋白質組學研究中的應用進展[J];生物技術通訊;2012年03期

7 都有為,倪剛;磁性納米材料的新進展[J];物理;1998年09期

8 ;[J];;年期

相關會議論文 前10條

1 劉沛;崔新愛;胡道道;;兩親性磁性納米材料的制備及其在深度脫硫中的應用[A];中國化學會第十三屆膠體與界面化學會議論文摘要集[C];2011年

2 侯仰龍;;磁性納米材料的化學控制合成[A];中國化學會第26屆學術年會無機與配位化學分會場論文集[C];2008年

3 曾瑤;侯仰龍;;各向異性磁性納米材料的控制合成及其電化學性能研究[A];中國化學會第27屆學術年會第08分會場摘要集[C];2010年

4 高利增;莊潔;聶棱;張錦彬;張宇;顧寧;王太宏;楊東玲;馮靜;Sarah Perrett;閻錫蘊;;四氧化三鐵磁性納米材料具有辣根過氧化物酶活性[A];第十屆中國科協(xié)年會論文集（三）[C];2008年

5 侯仰龍;;磁性納米材料的控制合成及其潛在應用探索研究[A];2011中國材料研討會論文摘要集[C];2011年

6 侯仰龍;;磁性納米材料的化學設計、控制合成及其潛在應用[A];2012中國功能新材料學術論壇暨第三屆全國電磁材料及器件學術會議論文摘要集[C];2012年

7 劉毅敏;趙先英;楊旭;王祥智;趙華文;;基于磁性納米材料的腫瘤治療研究[A];2007高技術新材料產(chǎn)業(yè)發(fā)展研討會暨《材料導報》編委會年會論文集[C];2007年

8 顏雪;韓三陽;張雪姣;姚建林;袁亞仙;顧仁敖;;磁性納米材料在重金屬離子分離及檢測中的應用[A];第十五屆全國光散射學術會議論文摘要集[C];2009年

9 郝瑞;吳佳佳;余靚;楊策;侯仰龍;;多功能磁性納米材料的化學設計、控制合成及其潛在應用探索研究[A];中國化學會第28屆學術年會第4分會場摘要集[C];2012年

10 劉吉眾;黃嫣嫣;劉國詮;趙睿;;表面分子印跡核殼磁性納米材料的制備與分析應用研究[A];全國生物醫(yī)藥色譜及相關技術學術交流會（2012）會議手冊[C];2012年

相關重要報紙文章 前1條

1 陽光;腫瘤早期診斷造影劑研究獲進展[N];中國醫(yī)藥報;2006年

相關博士學位論文 前9條

1 王建芝;功能化磁性納米材料的制備及其固定化酶的研究[D];蘭州大學;2015年

2 王曉白;Mn、Ni摻雜的Fe_3C磁性納米材料研究及應用[D];吉林大學;2016年

3 翟睿;功能化磁性納米材料的制備及其在蛋白質組學中的應用方法研究[D];北京工業(yè)大學;2016年

4 洪霞;磁性納米材料的合成、組裝及應用[D];吉林大學;2004年

5 張海濤;磁性納米材料的控制合成和物性研究[D];中國科學技術大學;2006年

6 朱浩;新型磁性納米材料的設計合成及固定化脂肪酶研究[D];蘭州大學;2013年

7 熊鷹;磁性納米材料的合成及磁場誘導組裝[D];中國科學技術大學;2007年

8 張希浩;硼酸功能化磁性材料的制備及其對目標糖蛋白的分離和富集[D];南開大學;2014年

9 湯慧利;新型磁性納米材料和介孔氧化硅材料的設計合成及應用研究[D];復旦大學;2008年

相關碩士學位論文 前10條

1 孟麗芬;中草藥中重金屬檢測方法研究[D];昆明理工大學;2015年

2 白柳;基于磁性納米材料的藻毒降解酶mlrA固定與性質檢驗[D];華中師范大學;2015年

3 朱娜;磁性功能材料在藥物負載及分析中的應用研究[D];沈陽理工大學;2015年

4 施云;磁性納米材料過氧化物模擬酶特性及其應用研究[D];北京化工大學;2015年

5 和富明;磁性納米材料固定阿魏酸酯酶及其酶學性質研究[D];齊魯工業(yè)大學;2015年

6 邢苗;針對汞、鎘重金屬離子的螯合吸附劑分子的合成及其應用性研究[D];新疆大學;2015年

7 黃丹妮;新型磁性納米材料在環(huán)境樣品分析中的應用研究[D];復旦大學;2014年

8 唐中開;納米多孔模板和一維磁性納米材料的制備與研究[D];電子科技大學;2015年

9 董麗萍;螯合法固定伴刀豆球蛋白磁性糖蛋白富集材料[D];新疆大學;2015年

10 孔巧玲;磁性納米材料在水體痕量有機污染物分析中的應用研究[D];浙江工業(yè)大學;2015年

，

本文編號：1370659