本文關(guān)鍵詞：納米銅和硫酸銅暴露致斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）中毒機理的比較研究　出處：《南京農(nóng)業(yè)大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：納米銅(Cu-NPs)的誕生給畜牧獸醫(yī)行業(yè)、飼料工業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展帶來了技術(shù)上的革命。然而由于納米材料獨特的納米效應,導致Cu-NPs可能對生態(tài)系統(tǒng)帶來損害,其生物安全性資料極為匱乏。如今,Cu-NPs已在生產(chǎn)生活領(lǐng)域被廣泛應用(如:抗菌消毒劑、紡織、魚藥等),但最終匯集到海洋環(huán)境中。斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)是我國沿海地區(qū)重要的養(yǎng)殖對象,其受到Cu-NPs的影響是不可避免的。目前,在養(yǎng)殖過程中常使用硫酸銅(CuS04)達到殺菌除藻的目的,但于此同時,離子Cu對魚類產(chǎn)生較大的毒害,因此新型Cu藥劑(Cu-NPs)的應用對水產(chǎn)養(yǎng)殖具有重大意義,然其應用基礎(chǔ)理論較為缺乏。在本研究中,我們利用傳統(tǒng)毒理學的研究方法結(jié)合現(xiàn)代組學技術(shù)系統(tǒng)比較研究Cu-NPs和離子Cu暴露對斜帶石斑魚及其致病弧菌的毒性作用,從而較為全面的獲得Cu-NPs和離子Cu各自的毒性作用特點和毒性機制信息。本研究為探索海洋納米毒理學的研究提供理論基礎(chǔ)和實踐經(jīng)驗,為Cu-NPs在海水養(yǎng)殖中的使用提供理論指導。試驗分為七個部分,主要結(jié)果如下:1)納米銅和硫酸銅暴露對斜帶石斑魚生長及積累效應的研究。結(jié)果如下:通過透射電鏡分析表明Cu-NPs的初始粒徑大小為85 ±29 runm (n=60),有積聚現(xiàn)象。通過納米追蹤分析表明Cu-NPs在海水中的平均粒徑大小為210±130nm。整個試驗過程無死亡。隨著Cu-NPs和Cu~(2+)處理濃度的提高,增重率、特定增長率、蛋白質(zhì)效率、餌料系數(shù)和臟體指數(shù)都呈現(xiàn)負面效應,其中Cu~(2+)誘導的負面效應比Cu-NPs明顯。積累試驗結(jié)果表明,在第0天(對照組),Cu在各組織中的分配比例順序為剩余組織(含魚頭、鰭、骨頭等)肌肉皮和鱗肝腸鰓胃。隨著Cu-NPs和Cu~(2+)處理時間的延長,Cu在剩余組織中的分配比例降低(Cu~(2+)處理降低量高于Cu-NPs處理),但在其它組織中分配比例提高,尤其在肝組織中。Cu在各組織中的積累量隨著暴露天數(shù)的增加而增加。吸收動力學表明,Cu~(2+)的吸收動力學曲線高于Cu-NPs。Cu~(2+)比Cu-NPs處理誘導更低的Km和Cmax/ Csat值,但誘導的BCF和In值在Cu~(2+)處理比Cu-NPs處理時高。當暴露到第10天時,Cu~(2+)與Cu-NPs具有同等的吸收量。2)納米銅和硫酸銅暴露對斜帶石斑魚顯微和亞顯微結(jié)構(gòu)的影響。顯微結(jié)果顯示:暴露25天后,各組織顯示出不同程度的損傷,隨著Cu-NPs和Cu~(2+)處理濃度的提高各組織的損傷程度也提高。對肝的損傷主要包括:血竇擴張和血細胞沉積在靜脈中;對鰓顯微結(jié)構(gòu)的變化主要包括:二次片層基部增生,二次片層頂部棒狀,鰓絲上動脈瘤。對肌肉的病變主要表現(xiàn)為:肌肉間隙擴大,部分肌束退變。在對照組中,斜帶石斑魚顯示正常的腸道結(jié)構(gòu)。低濃度的Cu-NPs和Cu~(2+)處理使腸道中杯狀細胞數(shù)增多,隨著處理濃度的升高,腸道中還出現(xiàn)絨毛糜爛現(xiàn)象。Cu-NPs對腸道的損害比Cu~(2+)嚴重。Cu-NPs和Cu~(2+)處理引起的腎組織病變有所差異,Cu-NPs主要引起腎臟中黑色素巨噬細胞增多,而Cu~(2+)處理誘導腎臟中紅髓面積減少、白髓面積增加。Cu-NPs和Cu~(2+)暴露都誘導心臟中血細胞堆積和空泡變性。整個結(jié)果表明,Cu-NPs誘導肝、鰓、肌肉、腸和心臟中的損傷與Cu~(2+)類似,但在腎中結(jié)果不同。亞顯微結(jié)果表明,正常斜帶石斑魚肝細胞核圓潤,核仁在核中央,有一些脂滴。Cu-NPs和Cu~(2+)處理都使肝細胞核塌陷,脂滴消失,溶酶體消失,出現(xiàn)空泡化。正常斜帶石斑魚鰓中氯細胞較為圓潤。Cu-NPs和Cu~(2+)處理都使鰓氯細胞塌陷,但氯細胞數(shù)增加。3)納米銅和硫酸銅暴露對斜帶石斑魚氧化應激及凋亡的影響。結(jié)果表明:在肝、鰓和腸中,丙二醛(MDA)的含量隨著Cu-NPs和Cu~(2+)處理濃度的升高而升高。在肝和鰓中,Cu~(2+)誘導MDA的升高量高于同等濃度的Cu-NPs,但在腸中結(jié)果相反。在肝和鰓中,總超氧化物歧化酶(T-SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽(GSH)的含量隨著Cu-NPs和Cu~(2+)處理濃度的升高而降低,Cu~(2+)誘導的降低趨勢比Cu-NPs明顯。在腸中,T-SOD活性隨著Cu-NPs和Cu~(2+)處理濃度的升高而升高;而CAT活性和GSH含量隨著處理濃度的升高而降低,Cu-NPs誘導的降低趨勢比同等濃度的Cu~(2+)明顯。細胞凋亡原位檢測統(tǒng)計分析和Caspase-3, -9活性分析表明,凋亡指數(shù)和Caspase-3, -9活性都隨著處理濃度的升高而升高。在肝和鰓中,Cu~(2+)誘導的凋亡指數(shù)和Caspase-3,-9活性要高于同等劑量的Cu-NPs;但在腸中此結(jié)果相反。在肝,鰓和腸中,琥珀酸脫氫酶(SDH)、Na+-K+-ATPase活性和線粒體細胞色素c含量都隨著Cu-NPs和Cu~(2+)處理濃度的升高而降低,但胞漿細胞色素c含量隨著處理濃度的升高而升高;這些變化在肝和鰓中在Cu~(2+)處理處有最大值,但在腸中在Cu-NPs處理處有最大值。4)納米銅和硫酸銅暴露對斜帶石斑魚毒性作用的轉(zhuǎn)錄組學研究。結(jié)果表明:Cu-NPs在試驗海水中暴露24-h后有約占初始總Cu量的0.83%的離子Cu釋放出來。血液指標分析表明,Cu-NPs誘導血清中的皮質(zhì)醇和血糖的升高量顯著高于Cu~(2+)處理組,但膽固醇和甘油三酯的含量在Cu-NPs處理處有最低值。轉(zhuǎn)錄組分析表明,Cu~(2+)和Cu-NPs處理分別誘導了 1,428和2,239個基因顯著表達;這些基因中有911個基因共表達。GO功能分析表明,共有28,788 GO條目被分配到11,417轉(zhuǎn)錄本。COG分析表明,有11,619個轉(zhuǎn)錄本被分為25類。其中,“信號傳導機制”的數(shù)量最多,為1,745(15.0%)個。KEGG通路分析表明,基因數(shù)目最多的前3個Pathway依次為信號轉(zhuǎn)導、免疫系統(tǒng)、運輸和分解代謝。本試驗利用RT-PCR的方法對轉(zhuǎn)錄組結(jié)果做了進一步驗證,結(jié)果表明:基因在Illumina測序結(jié)果中的表達趨勢與RT-PCR中的表達趨勢一致,僅僅有表達量的不同,這可能是由試驗計算方法不同造成的。5)納米銅和硫酸銅暴露對斜帶石斑魚毒性作用的蛋白質(zhì)組學研究。結(jié)果表明:Cu~(2+)和Cu-NPs處理分別誘導了 354和140個蛋白顯著表達;這些蛋白中有75個蛋白共表達。GO功能分析表明,共有10,506 GO條目被分配到3,210個蛋白。COG分析表明,有3,294個蛋白被分為24類。其中,“只有一般功能預測”數(shù)量最多,為630( 19.1%)個。KEGG通路分析表明,蛋白數(shù)目最多的前3個Pathway依次為脂質(zhì)代謝、免疫系統(tǒng)、糖代謝。本試驗利用Western bolt的方法對蛋白質(zhì)組結(jié)果做了進一步驗證,結(jié)果表明:蛋白在iTRAQ測序結(jié)果中的表達趨勢與Western bolt中的表達趨勢一致。轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組關(guān)聯(lián)分析表明,共有21個蛋白在不同形式的Cu處理下在轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組水平共表達:其中共同上調(diào)的有13個,共同下調(diào)的有8個。這些蛋白所涉及到的最主要的功能為脂質(zhì)代謝。在本研究中,我們利用生理指標(脂質(zhì)含量及脂肪酸組成)對脂質(zhì)代謝做了進一步的研究。結(jié)果表明,Cu-NPs和Cu~(2+)暴露對脂代謝相關(guān)生理指標產(chǎn)生顯著影響。6)納米銅和硫酸銅暴露對斜帶石斑魚毒性作用的體外肝細胞驗證。結(jié)果表明:Cu-NPs在細胞培養(yǎng)基中的粒徑(100±35nm)大于Cu-NPs初始粒徑(80±32nm),但比其在海水中的粒徑小。Cu-NPs和Cu~(2+)暴露24-h后原代肝細胞活力顯著降低;在Cu~(2+)處理降低的量顯著高于Cu-NPs處理。本試驗通過對氧化脅迫相關(guān)指標(ROS、MDA、T-SOD、CAT和GSH)、細胞凋亡、caspase-3,-8,-9活性以及線粒體和胞漿中的細胞色素c含量進行測定,發(fā)現(xiàn)其變化趨勢與體內(nèi)肝臟中一致,這對第四章結(jié)果做了進一步驗證。在本試驗中,Cu-NPs和Cu~(2+)暴露顯著抑制抗氧化脅迫相關(guān)基因[SOD(Cu/Zn),SOD(Mn),CAT,GPx4]表達;而凋亡相關(guān)基因(p53,p38β,TNF-α)表達顯著上升;這些在Cu~(2+)處理處有最大值。Western bolt分析表明,Cu-NPs和Cu~(2+)暴露24-h后,與空白比,SOD蛋白表達被抑制,而p53蛋白表達上升。Cu~(2+)誘導SOD和p53蛋白表達變化比Cu-NPs明顯。7)體外致病菌毒性試驗表明,哈氏弧菌、河流弧菌和副溶血弧菌的生長量被Cu-NPs和Cu~(2+)顯著抑制。低濃度Cu(4.12mg/L)處理,Cu-NPs對這3株弧菌的生長抑制作用及氧化損傷比Cu~(2+)明顯。高濃度Cu處理("g0.5g/L), Cu~(2+)對這3株弧菌所產(chǎn)生的抑菌圈直徑大于Cu-NPs處理所產(chǎn)生。結(jié)合實際生產(chǎn),Cu-NPs有望替代傳統(tǒng)的CuSO_4在治療石斑魚弧菌病中的應用。
【學位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：X171.5;S943

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