發(fā)布時間：2017-12-22 04:34

  本文關(guān)鍵詞：表皮生長因子受體及多配體蛋白聚糖4在豬繁殖與呼吸綜合征病毒入胞過程中的作用機制　出處：《南京農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)屬于動脈炎病毒科動脈炎病毒屬,為有囊膜的單股正鏈RNA病毒,感染PRRSV可引起以母豬繁殖障礙、流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、仔豬和育成豬呼吸道癥狀及高死亡率為主要特征的傳染病。目前該病已在全球范圍內(nèi)傳播,嚴重地威脅著世界養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。以往的研究主要集中于對PRRSV感染與宿主免疫應(yīng)答機制的探索,而對PRRSV的吸附及入胞的機制研究還不是很清楚。本研究主要針對PRRSV入胞過程中激活的信號通路和其分子機制的探討,以及對PRRSV吸附受體的研究。主要研究內(nèi)容包括:1.酪氨酸激酶在豬繁殖與呼吸綜合征病毒入胞過程中作用的研究蛋白酪氨酸激酶介導(dǎo)許多胞內(nèi)外信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)和處理,在腫瘤發(fā)生過程中,它們對調(diào)節(jié)細胞生長和分化起到關(guān)鍵的作用。我們研究了蛋白酪氨酸激酶在PRRSV入胞中的作用。結(jié)果表明,PRRSV入胞過程中激活Src和EGFR,并且用它們特異性抑制劑Genistein, PP2, SU6656和八G1478作用細胞后能顯著抑制病毒的入胞,說明PRRSV利用酪氨酸激酶的活性來促進病毒入胞。并且Src與EGFR在MARC-145細胞中具有相互作用。我們又著重研究了 EGFR對PRRSV入胞的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),過表達EGFR或激活EGFR可促進PRRSV的入胞,而減少EGFR的表達或抑制EGFR的活性均使病毒入胞明顯降低。這些結(jié)果表明,PRRSV激活Src和EGFR及其相關(guān)信號分子促進其進入MARC-145細胞。2. EGFR-PI3K/AKT-LIMK-cofilin信號通路參與豬繁殖與呼吸綜合征病毒入胞的研究利用western blot、熒光定量PCR等技術(shù)分析PRRSV進入MARC-145細胞過程中激活的信號分子及通路。結(jié)果表明,PRRSV在進入細胞過程中可以激活包括PI3K、AKT、LIMK1和cofilin在內(nèi)的信號分子,信號通路的激活有利于調(diào)節(jié)細胞骨架變化并介導(dǎo)病毒入胞。我們利用特異性抑制劑驗證信號分子在通路中的上下游關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn),EGFR的特異性抑制劑AG1478可以抑制PI3K、AKT、LIMK1和cofilin的激活;PI3K的特異性抑制劑LY294002可以抑制AKT、LIMK1和cofilin的激活;ROCK特異性抑制劑Y27632可以抑制LIMK1和cofilin的激活。并且PI3K的特異性抑制劑LY294002和AKT特異性抑制劑Ⅷ及ROCK特異性抑制劑Y27632可以抑制病毒的入胞。干擾cofilin表達后病毒入胞顯著降低;降低cofilin表達后再瞬時轉(zhuǎn)染cofilin組成性激活突變體可部分回補病毒的入胞。我們的研究結(jié)果表明PRRSV入胞過程會激活EGFR/PI3K/AKT-LIMK1-cofilin信號通路,并利用該通路來促進病毒的入胞過程。3.多配體蛋白聚糖4在豬繁殖與呼吸綜合征病毒吸附和入胞機制中的研究進展我們對PRRSV進入MARC-145細胞過程中多配體蛋白聚糖4 (syndecan 4)的分布及作用進行了研究。結(jié)果表明,PRRSV在4℃與細胞孵育時syndecan4位于細胞的表面,而在病毒進入細胞過程中可以使syndecan 4內(nèi)吞進入胞質(zhì)中。通過試驗我們發(fā)現(xiàn),syndecan 4抗體可以抑制病毒的吸附,用syndecan 4特異性siRNA干擾掉syndecan 4后病毒吸附水平明顯降低。并且,過表達syndecan 4后PRRSV的吸附和入胞均顯著增加。為驗證syndecan4與EGFR相互作用在病毒吸附和入胞中的作用,我們利用syndecan4的結(jié)合肽處理細胞,結(jié)果顯示,病毒的入胞顯著降低,而病毒的吸附?jīng)]有顯著變化,即syndecan 4與EGFR相互作用介導(dǎo)PRRSV的入胞。為驗證EGFR對syndecan 4內(nèi)吞的影響,我們利用免疫熒光方法發(fā)現(xiàn),用EGFR特異性抑制劑AG1478和syndecan 4的結(jié)合肽處理細胞后能顯著抑制病毒入胞誘導(dǎo)的syndecan 4的內(nèi)吞。以上結(jié)果表明,PRRSV利用syndecan 4吸附在MARC-145細胞表面,并通過syndecan 4與EGFR的相互作用來介導(dǎo)病毒的入胞。4.多配體蛋白聚糖4在豬繁殖與呼吸綜合征病毒入胞過程中介導(dǎo)的信號通路。用syndecan 4特異性siRNA干擾syndecan 4后能顯著抑制病毒誘導(dǎo)的FAK、Src和EGFR的磷酸化。并且我們發(fā)現(xiàn)PRRSV入胞過程中激活鈣結(jié)合蛋白Annexin A2(Anx A2 )。用Annexin A2特異性siRNA干擾Annexin A2后能顯著抑制PRRSV的入胞,而過表達Annexin A2則能促進病毒的入胞,這表明Annexin A2參與PRRSV的入胞。而且,FAK特異性的抑制劑PF573228、Src抑制劑PP2及EGFR抑制劑AG1478能夠顯著抑制病毒誘導(dǎo)的Annexin A2的激活。干擾掉Annexin A2后,病毒入胞誘導(dǎo)的EGFR、Src和cofilin的磷酸化也減少,表明在PRRSV入胞過程中Annexin A2同樣也能調(diào)節(jié)EGFR和Src的活性,并通過調(diào)節(jié)細胞骨架來介導(dǎo)病毒的入胞。
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.651
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本文編號：1318472