本文關(guān)鍵詞：米曲霉蛋白分泌壓力反饋調(diào)控機制研究　出處：《華南理工大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：米曲霉因具有強大的胞外蛋白分泌能力而被廣泛應(yīng)用于蛋白表達研究,但與同源蛋白相比,異源蛋白的產(chǎn)量卻很低。主要原因是在米曲霉中異源蛋白不能進行有效的加工、轉(zhuǎn)運、分類和分泌,導致非折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)累積。當?shù)鞍椎恼郫B需求超過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的加工能力就會誘導激活非折疊蛋白反饋調(diào)節(jié)機制(UPR)來緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力。UPR的激活主要依賴于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)膜激酶/內(nèi)切核糖核酸酶IRE1和亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子HacA組成的信號級聯(lián)放大過程。目前米曲霉UPR的研究常通過添加刺激性化學物質(zhì)、過量表達異源或同源蛋白以及改變培養(yǎng)條件等方式誘導激活,但由于尚未成功構(gòu)建UPR關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子HacA的相關(guān)功能菌株,因此在米曲霉UPR機制中HacA對蛋白分泌途徑基因的調(diào)控作用仍無法得到準確評估,這是本論文研究的科學問題之一。在絲狀真菌中除了UPR,還存在另外一個被稱為分泌壓力應(yīng)答抑制(RESS)的保護機制,通過抑制分泌蛋白基因的轉(zhuǎn)錄來緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力,目前的研究推導認為RESS是通過分泌蛋白基因的啟動子介導,但這些啟動子上介導RESS的順式成分(序列)仍不明確,這也是本論文研究的另一個科學問題。本論文將通過構(gòu)建HacA缺失和組成型激活突變菌并結(jié)合全基因組轉(zhuǎn)錄測序,全面的表征HacA在分泌途徑和整個細胞代謝過程中的調(diào)控作用;同時以米曲霉的淀粉酶為模式基因詳細分析參與RESS激活的關(guān)鍵順式序列。具體研究內(nèi)容如下:(1)米曲霉高效同源重組遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建與應(yīng)用研究通過敲除米曲霉niaD300中非同源末端連接(NHEJ)途徑中的關(guān)鍵基因ku70,減少了非同源事件,獲得高效同源重組菌(niaD-;ku70::ptrA);并以此為基礎(chǔ),利用同源整合敲除pyrG基因作為雙向篩選標記(niaD-;△pyrG;ku70::ptrA),以及敲除蛋白酶調(diào)控基因prtT構(gòu)建蛋白缺失的表達宿主(niaD-;△prtT;△pyrG;ku70::ptrA),同時轉(zhuǎn)錄和胞外蛋白分析結(jié)果顯示敲除prtT能夠抑制蛋白酶表達。(2)UPR缺失與組成型激活突變菌的構(gòu)建及其生長表型和蛋白分泌研究基于已構(gòu)建的高效同源重組的宿主菌(niaD-;△pyrG;ku70::ptrA),利用同源重組技術(shù)成功構(gòu)建了UPR缺失突變菌(HacA-DE,HacA-DE-RE)和不同啟動子調(diào)控的UPR組成型激活突變菌(HA(HacA-CA),HAGFP,HALGFP,HA-gpdA,HAGFP-gpdA,HALGFP-gpdA,HA-amyB,HAGFP-amyB和HALGFP-amyB)。通過對獲得的UPR缺失突變菌和不同類型UPR組成型激活突變菌的生長表型和胞外分泌蛋白分析顯示,在菌體正常生長過程中UPR機制關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子HacA的表達必須保持一定的閾值水平,過高或者過低都會對菌體產(chǎn)生有害的影響,如抑制菌體生長和胞外蛋白的分泌。(3)UPR關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子HacA敲除菌與組成型表達菌的轉(zhuǎn)錄組水平差異研究采用RNA-seq技術(shù)對UPR缺失突變菌HacA-DE和組成型激活突變菌(HacA-CA)進行轉(zhuǎn)錄組測序,獲得了米曲霉的全基因組水平轉(zhuǎn)錄圖譜�；谵D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),UPR的缺失和組成型激活導致差異基因主要聚類在蛋白分泌途徑、氨基酸代謝、脂類代謝和糖代謝四個方面,這說明UPR在這些途徑調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。為了進一步了解UPR的缺失和組成型激活對分泌途徑的影響,將獲得的HacA-CA和HacA-DE轉(zhuǎn)錄組差異表達基因與已知的369個分泌途徑相關(guān)基因進行映射分析,結(jié)果顯示以niaD300和HacA-DE為參照,HacA-CA中共有80個基因出現(xiàn)差異表達;以niaD300為參照,HacA-DE中有36個基因出現(xiàn)差異表達;同時對上述的80和36個差異基因進行歸類分析,發(fā)現(xiàn)這些差異基因主要參與蛋白折疊/UPR、糖基化、囊泡運輸?shù)冗^程。同時我們還發(fā)現(xiàn)HacA-CA和HacA-DE突變菌中參與糖代謝作用基因的轉(zhuǎn)錄水平大部分出現(xiàn)共同下調(diào),特別是淀粉水解酶類基因,這個結(jié)果說明在UPR的缺失和組成型激活條件下,RESS均參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力的調(diào)控。另外,我們將米曲霉UPR組成型激活、DTT脅迫和amyB過量表達條件下的六組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行比較表達差異分析,結(jié)果顯示有28個基因的轉(zhuǎn)錄共同出現(xiàn)顯著的差異表達,作者認為這些可能是參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力調(diào)控的重要基因。(4)RESS機制的研究及順式作用元件鑒定以米曲霉經(jīng)典的淀粉酶基因amyB為分泌蛋白的模式基因,外源表達分泌脂肪酶尺ML為報告基因,通過對amyB啟動子進行系列的截短和缺失突變分析,在amyB啟動子上鑒定出一段參與RESS調(diào)控的順式作用元件(-378到-291),并且-307到-300的八核酸序列TCACGGGC是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力下調(diào)控amyB下調(diào)的核心序列。同時通過與UPR缺失與組成型激活研究結(jié)果綜合分析,我們認為AmyR的失活和RESS均參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力下的amyB的轉(zhuǎn)錄抑制調(diào)控。
【學位授予單位】：華南理工大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q936
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本文編號：1318933