本文關(guān)鍵詞：智能響應(yīng)性納米載體的基因輸送與腫瘤治療的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：腫瘤是新世紀人類的頭號殺手之一,基因治療可從根本上對腫瘤進行治療,但是裸露的基因不能直接用于治療,因為它會被生物體內(nèi)的酶酶解,因此必須有一定的載體對基因?qū)嵭斜Ｗo。人類的正常組織結(jié)構(gòu)致密,只允許小分子類物質(zhì)通過,腫瘤組織結(jié)構(gòu)完整性差,通透性變高,除了允許小分子類物質(zhì)通過還允許大分子類物質(zhì)通過,這就為納米顆粒用于基因輸送提供了可能。納米顆粒在基因輸送中有其獨特的優(yōu)勢,但與其他基因輸送方式類似,納米復(fù)合物在輸送基因的過程中,不可避免地面臨一些障礙,如：進入細胞時細胞膜的障礙、逃離溶酶體的障礙、基因在細胞質(zhì)中如何完全有效釋放的障礙及到達細胞核轉(zhuǎn)錄過程中核膜的障礙等。為此,本論文分別設(shè)計了HA-HP、電荷可翻轉(zhuǎn)的CS-Aco、Dexa和PEI-SS輔助基因載體克服上述障礙。具體工作主要分為以下四部分：(一)納米載體輸送基因時,需要克服細胞膜的障礙,因此本部分工作構(gòu)建了DNA/PEIS/HA-HP納米復(fù)合物。該體系在體液循環(huán)過程中穩(wěn)定存在,在HA的作用下,特異性的靶向腫瘤細胞表面CD44高表的腫瘤細胞后,在透明質(zhì)酸酶的作用下HA被酶解,露出的DNA/PEIS,在體內(nèi)還原性環(huán)境下,PEIS被降解為小分子量的的PEI。此時,正電荷的PEI與帶有負電荷HP通過靜電相互作用相結(jié)合,從而使原來和PEI結(jié)合的DNA釋放到細胞質(zhì)中。以輸送shBmi-1為例,發(fā)現(xiàn)PEIS/HA-HP能夠更有效地將shBmi-1導(dǎo)入到細胞中,敲低Bmi-1的表達。體外實驗該納米復(fù)合物發(fā)現(xiàn)可以使腫瘤細胞形成干性小球的能力削弱。體內(nèi)使裸鼠的腫瘤形成能力受損,并最終使小鼠有更好的愈后。(二)陽離子聚合物可以用于shRNA輸送,但是由于shRNA不能有效地從溶酶體中逃逸使其轉(zhuǎn)染效率較低,因此,本章工作采用層層自組裝方法構(gòu)建了具有三層結(jié)構(gòu)的納米載體(Au-PEI/CS-Aco/PEI/shRNA),以促進shRNA從溶酶體中逃出。該體系是在原來常用的納米體系上加入電荷可翻轉(zhuǎn)的CS-Aco。CS-Aco在正常情況下帶負電,而在溶酶體酸性環(huán)境下翻轉(zhuǎn)為正電荷,導(dǎo)致納米載體的瓦解。瓦解產(chǎn)生的Au-PEI和CS能夠有效的沖破溶酶體膜,將PEI/shRNA釋放到細胞質(zhì)中。由于分子量小(1.2 KDa)的PEI,與shRNA電荷相互作用較弱,所以在細胞質(zhì)中能輕松的將shRNA釋放。以輸送shABCG2為例,發(fā)現(xiàn)設(shè)計的納米載體能夠有效敲低細胞中ABCG2的表達,降低HepG2細胞對藥物的抵抗性。體外實驗證明,該系統(tǒng)有較好的腫瘤治療效果和較低的毒副作用。(三)基因需到細胞核才能完成轉(zhuǎn)錄,所有基因輸送體系都必須將基因輸送到細胞核。地塞米松(Dexa)有細胞核靶向性,因此將Dexa加到納米復(fù)合物中,通過激光共聚焦顯微鏡、核質(zhì)分離等實驗,發(fā)現(xiàn)Au-PEI/DNA/PEI-Dexa確實能夠促進納米顆粒的細胞核靶向性,并促進shRNA進入細胞核。該體系以輸送pTRAIL為例,發(fā)現(xiàn)Au-PEI/DNA/PEI-Dexa能夠?qū)⒏鄍TRAIL轉(zhuǎn)輸?shù)郊毎酥?促進TRAIL蛋白的表達,而TRAIL蛋白對于細胞凋亡及其重要,特別是能夠特異地影響到腫瘤細胞的凋亡,通過高表達TRAIL蛋白促進腫瘤細胞凋亡。小鼠實驗中,Au-PEI/DNA/PEI-Dexa處理組的腫瘤更小,說明Au-PEI/DNA/PEI-Dexa復(fù)合物能通過增強TRAIL的表達最終影響腫瘤的大小。并且對比實驗組和對照組,小鼠的體重差異不大,說明該體系沒有對小鼠造成明顯的毒副作用。(四)基因載體在體液循環(huán)過程中,或者在腫瘤組織中要能夠?qū)驅(qū)嵭泻芎玫谋Ｗo,但是當基因載體把基因運送到細胞質(zhì)進行轉(zhuǎn)錄的時候,又必須能夠?qū)⒒蛲耆尼尫诺郊毎|(zhì)中。為了使基因的保護和釋放之間得到平衡,本部分工作根據(jù)細胞內(nèi)外氧化還原環(huán)境和pH值的不同,設(shè)計了能夠?qū)δ[瘤細胞內(nèi)的還原性環(huán)境和pH變化做出雙響應(yīng)的基因載體PA-PEI-SS。本部分工作利用凝膠電泳實驗驗證載體對基因的保護作用,并且模擬了細胞內(nèi)酸性和還原性的環(huán)境,驗證聚合物對基因的釋放效果。實驗結(jié)果證明,該載體對基因能夠?qū)嵤┖芎玫谋Ｗo,并且在外界環(huán)境變化的時候,使基因有效的釋放到細胞質(zhì)中。通過細胞毒性實驗也驗證了該載體并沒有對細胞造成明顯的毒性,而且轉(zhuǎn)染效率也比PEI 25KDa有了明顯提高。總之,本論文是在常用的陽離子聚合物PEI的基礎(chǔ)上,針對于基因轉(zhuǎn)輸過程中遇到的障礙,設(shè)計了一系列智能響應(yīng)的納米復(fù)合物,并用重要的生物分子檢測納米復(fù)合物的效果,發(fā)現(xiàn)此系列納米復(fù)合物確實能夠通過輸送基因影響細胞或者小鼠對應(yīng)的生物學(xué)功能。
【關(guān)鍵詞】：非病毒載體 腫瘤 智能響應(yīng) 基因治療
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：TQ460.1;TB383.1
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-12
• 第一章 文獻綜述及選題指導(dǎo)思想12-47
• 1.1 腫瘤的產(chǎn)生及治療現(xiàn)狀12-13
• 1.2 納米顆粒用作基因輸送載體13-16
• 1.3 基因輸送過程中遇到的障礙16-20
• 1.3.1 細胞外障礙16-18
• 1.3.2 細胞內(nèi)障礙18-20
• 1.4 合理設(shè)計基因載體20-29
• 1.4.1 聚合物基因載體20-24
• 1.4.2 制備基因輸送體系的主要方法24
• 1.4.3 設(shè)計靶向性的基因治療運載系統(tǒng)24-29
• 1.5 實驗中涉及到的重要生物學(xué)概念29-35
• 1.5.1 shRNA29-30
• 1.5.2 腫瘤干細胞和Bmi-130-33
• 1.5.3 ABCG2與耐藥33-34
• 1.5.4 TRAIL和細胞凋亡34-35
• 1.6 選題意義及指導(dǎo)思想35-36
• 參考文獻36-47
• 第二章 含有細胞膜靶向的層狀納米顆粒在體內(nèi)和體外的轉(zhuǎn)染研究47-69
• 2.1 引言47-48
• 2.2 實驗部分48-52
• 2.2.1 實驗材料48
• 2.2.2 肝素-透明質(zhì)酸(HA-HP)的制備48-49
• 2.2.3 三元復(fù)合物的組裝和表征49
• 2.2.4 復(fù)合物穩(wěn)定性的測試49-50
• 2.2.5 復(fù)合物在還原性條件下的穩(wěn)定性測試50
• 2.2.6 體外轉(zhuǎn)染實驗50-51
• 2.2.7 用酶聯(lián)免疫吸附實驗驗證復(fù)合物對小鼠的毒性51-52
• 2.2.8 腫瘤起始實驗驗證復(fù)合物遞送質(zhì)粒的效率52
• 2.2.9 測定復(fù)合物對腫瘤干細胞形成的影響52
• 2.2.10 用免疫組織化學(xué)方法檢測蛋白的表達52
• 2.3 結(jié)果與討論52-65
• 2.3.1 HA-HP的制備與表征52-54
• 2.3.2 復(fù)合物的形態(tài)和表征54-55
• 2.3.3 透明質(zhì)酸酶和氧化還原環(huán)境對復(fù)合物物理化學(xué)特性的影響55-57
• 2.3.4 HP的競爭作用對DNA釋放的促進作用57-58
• 2.3.5 復(fù)合物對細胞的毒性實驗58-59
• 2.3.6 復(fù)合物體外轉(zhuǎn)染實驗59-61
• 2.3.7 復(fù)合物的細胞攝取實驗61-62
• 2.3.8 小球形成實驗62-64
• 2.3.9 小鼠移植模型64-65
• 2.4 小結(jié)65
• 參考文獻65-69
• 第三章 具有增強溶酶體逃逸的納米載體輸送shRNA及其用于腫瘤治療的研究69-90
• 3.1 引言69-71
• 3.2 實驗部分71-76
• 3.2.1 實驗材料71
• 3.2.2 Au-PEI的合成71-72
• 3.2.3 CS-Aco和CS-Car的合成72
• 3.2.4 復(fù)合物的層層自組裝72
• 3.2.5 凝膠電泳實驗72
• 3.2.6 shRNA的釋放實驗72
• 3.2.7 細胞攝入實驗72-73
• 3.2.8 驗證阿霉素對細胞的毒性73
• 3.2.9 shABCG2的克隆73
• 3.2.10 HepG2細胞RNA的抽提73-74
• 3.2.11 實時定量PCR(Realtime PCR)74
• 3.2.12 免疫印跡試驗(Western Blot)74
• 3.2.13 流式細胞術(shù)(FACS)74-75
• 3.2.14 免疫組化(IHC)75
• 3.2.15 免疫熒光(IF)75
• 3.2.16 體內(nèi)移植瘤實驗75-76
• 3.2.17 統(tǒng)計分析76
• 3.3 結(jié)果與討論76-87
• 3.3.1 Au-PEI/CS-Aco/PEI/shRNA的負載實驗及檢測76-77
• 3.3.2 shRNA與Au-PEI/CS-Aco/PEI的復(fù)合能力77
• 3.3.3 pH對shRNA釋放的影響77-78
• 3.3.4 細胞對Au-PEI/CS-Aco/PEI/shRNA的攝取效率78-80
• 3.3.5 shRNA內(nèi)涵體逃逸效果80-81
• 3.3.6 細胞毒性實驗81-82
• 3.3.7 細胞內(nèi)ABCG2的表達量82-83
• 3.3.8 Au-PEI/CS-Aco/PEI/shABCG2增強細胞對藥物的敏感性83-85
• 3.3.9 藥物在腫瘤細胞的富集85
• 3.3.10 腫瘤的治療效果85-87
• 3.4 小結(jié)87
• 參考文獻87-90
• 第四章 具有核靶向功能的納米顆粒在體內(nèi)和體外的轉(zhuǎn)染研究90-110
• 4.1 引言90-92
• 4.2 實驗部分92-96
• 4.2.1 實驗材料92
• 4.2.2 Au-PEI納米顆粒的合成92
• 4.2.3 PEI-Dexa的合成92
• 4.2.4 Au-PEI/DNA/PEI-Dexa三元復(fù)合物的制備92
• 4.2.5 Au-PEI/DNA/PEI-Dexa的表征92-93
• 4.2.6 復(fù)合物對細胞的毒性實驗93
• 4.2.7 體外轉(zhuǎn)染實驗93
• 4.2.8 Cy5標記DNA的實驗過程93
• 4.2.9 細胞內(nèi)吞實驗93-94
• 4.2.10 復(fù)合物在細胞內(nèi)的共定位實驗94
• 4.2.11 核質(zhì)分離實驗94
• 4.2.12 TRAIL克隆94-95
• 4.2.13 體內(nèi)轉(zhuǎn)染實驗95
• 4.2.14 免疫組化95
• 4.2.15 免疫印跡95
• 4.2.16 檢測TRAIL的表達量實驗95-96
• 4.3 結(jié)果與討論96-107
• 4.3.1 Au-PEI/DNA/PEI-Dexa的合成96-97
• 4.3.2 Au-PEI/DNA/PEI-Dexa納米復(fù)合物的表征97-100
• 4.3.3 細胞毒性100-101
• 4.3.4 體外轉(zhuǎn)染101-102
• 4.3.5 細胞攝入實驗102
• 4.3.6 納米復(fù)合物在細胞內(nèi)的分布102-104
• 4.3.7 核質(zhì)分布104-105
• 4.3.8 體內(nèi)基因輸送能力105-107
• 4.4 小結(jié)107
• 參考文獻107-110
• 第五章 雙響應(yīng)納米載體的合成及基因遞送的研究110-128
• 5.1 引言110-111
• 5.2 實驗部分111-114
• 5.2.1 實驗材料111-112
• 5.2.2 實驗方法112-113
• 5.2.3 細胞培養(yǎng)113
• 5.2.4 細胞毒性113-114
• 5.2.5 體外轉(zhuǎn)染實驗114
• 5.3 結(jié)果與討論114-124
• 5.3.1 PA-PEI-SS的合成和表征114-116
• 5.3.2 復(fù)合物的特征116-120
• 5.3.3 聚合物的雙重降解特性120-121
• 5.3.4 細胞毒性實驗121-122
• 5.3.5 體外轉(zhuǎn)染122-124
• 5.4 小結(jié)124
• 參考文獻124-128
• 主要結(jié)論128-130
• 博士研究生階段主要研究成果130-131
• 致謝131

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