發(fā)布時間：2018-05-15 21:30

  本文選題：豬小腸粘膜 + 黏蛋白　； 參考：《中國海洋大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：本文以豬小腸黏膜肝素加工廢棄物為原料,分別采用60℃熱水、胰蛋白酶(EC3.4.21.4)、2709堿性蛋白酶(CAS：9014-01-1)、胃蛋白酶(CAS：9001-75-6)和枯草桿菌蛋白酶(EC3.4.21.14)提取共獲得5種黏蛋白粗品,Ims-W、Ims-Y、 Ims-YJ、Ims-A和Ims-N。它們的收率分別為0.30%、1.21%、4.03%、0.34%及1.22%。對5種黏蛋白粗品的基本理化性質(zhì)進行分析,并采用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)對其單糖組成進行測定。結(jié)果表明,Ims-W、Ims-Y、Ims-YJ、Ims-A和Ims-N的重均分子量分別為1371kDa、1028kDa、665 kDa、684 kDa和839 kDa,蛋白含量分別為51.23%、27.24%、36.97%、56.78%和44.21%,硫酸根含量均低于5%。單糖組成分析表明5種黏蛋白粗品主要由氨基半乳糖(GalN)、氨基葡萄糖(GlcN)、半乳糖(Gal)、巖藻糖(Fuc)、N-乙酰神經(jīng)氨酸(NeuAc)和N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(NeuGc)組成。因提取工藝不同,樣品中的唾液酸含量差別較大,NeuAc和NeuGc的含量一般在2.91%～17.58%及4.61%～12.71%之間。對酶提樣品Ims-Y和Ims-YJ進一步純化并借助質(zhì)譜手段進行結(jié)構(gòu)表征。根據(jù)電荷密度分布不同,采用強陰離子交換層析從Ims-Y和Ims-YJ粗品中共得到六個純化組分,即Ims-Y-0.6、Ims-Y-0.8、Ims-Y-1.0、Ims-YJ-0.6、Ims-YJ-0.8和Ims-YJ-1.0,它們的收率分別為73.21%、3.22%、5.35%、83.33%、1.67%和2.89%。理化性質(zhì)分析結(jié)果表明,Ims-Y-0.6、Ims-Y-0.8、Ims-Y-1.0、Ims-YJ-0.6、Ims-YJ-0.8和Ims-YJ-1.0的蛋白含量分別為20.34%、30.91%、10.90%、31.06%、10.78%和13.96%,硫酸根含量分別為3.43%、8.71%、13.92%、3.16%、9.13%和17.21%,重均分子量分別為763 kDa、24 kDa、31 kDa、658 kDa、21 kDa和22 kDa。RP-HPLC單糖組成分析表明,Ims-Y-0.6、Ims-Y-0.8、Ims-Y-1.0、Ims-YJ-0.6、Ims-YJ-0.8和Ims-YJ-1.0中均主要由GalN、GIcN、Gal和Fuc組成,其中Ims-Y-1.0和Ims-YJ-1.0還含有13%～16%的葡萄糖醛酸(GlcA)。此夕,Ims-Y-0.6和Ims-YJ-0.6均含NeuGc和NeuAc,且它們的含量在11.82%～36.14%之間,而另外4個組分則不含NeuGc和NeuAc。進一步對黏蛋白Ims-Y-0.6和Ims-YJ-0.6結(jié)構(gòu)分析,首先采用還原β-消除法對Ims-Y-0.6和Ims-YJ-0.6進行O-糖鏈釋放,然后選擇Bio-gel P2凝膠滲透色譜對釋放的寡糖醇混合物進行分離。根據(jù)Bio-gel P2純化結(jié)果,采用電噴霧碰撞誘導(dǎo)串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-CID-MS/MS)技術(shù)對Ims-Y-0.6中釋放的寡糖進行二級質(zhì)譜分析。結(jié)合文獻中關(guān)于O-糖鏈結(jié)構(gòu)解析質(zhì)譜規(guī)律,利用特征離子,從核心結(jié)構(gòu)類型,硫酸根、唾液酸、巖藻糖取代位置以及連接方式等方面確定了26個O-糖鏈結(jié)構(gòu),表明該樣品為高唾液酸化、GlcNAc C-6位硫酸根取代、抗原表位主要為Blood group H型的黏蛋白。最后,本文采用Raw264.7細胞吞噬中性紅實驗,探討了從豬小腸黏膜肝素加工廢棄物中所獲得的黏蛋白對巨噬細胞吞噬能力的影響,結(jié)果表明,在一定濃度下,該類黏蛋白可以活化巨噬細胞,促進其吞噬能力,顯示了較好的免疫增強活性。以上結(jié)果為該高糖基化黏蛋白的進一步開發(fā)利用提供了有用參考。
[Abstract]:In this paper, using porcine intestinal mucosa heparin processing waste as raw material, five kinds of mucin crude products Ims-Wims-Y, Ims-YJK Ims-A and Ims-Ns were obtained by using hot water at 60 鈩，

本文編號：1894034