本文關(guān)鍵詞：粗糙脈孢菌C_2H_2突變株篩選及基因功能研究

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【摘要】：絲狀真菌的木質(zhì)纖維素水解酶基因在可溶性誘導(dǎo)物的誘導(dǎo)作用下表達(dá),其表達(dá)水平取決于轉(zhuǎn)錄激活子和阻遏因子的共同作用。因此,挖掘、解析這些纖維素酶基因表達(dá)調(diào)控關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子對(duì)提高木質(zhì)纖維素水解酶的產(chǎn)量具有重要的理論指導(dǎo)和實(shí)際應(yīng)用意義。為了進(jìn)一步挖掘調(diào)控纖維素酶表達(dá)的新型轉(zhuǎn)錄因子,本研究以粗糙脈孢菌鋅指轉(zhuǎn)錄因子C2H2家族的57株單基因突變體為研究對(duì)象,在以2%結(jié)晶纖維素為唯一碳源的培養(yǎng)條件下進(jìn)行篩選,并且對(duì)這些突變體的發(fā)酵液中蛋白濃度、內(nèi)切p-1,4-葡聚糖酶酶活、外切纖維素酶酶活、p-葡萄糖苷酶酶活及生物量進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示,7株突變體的蛋白產(chǎn)量及內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶酶活均比野生型有25%-77%不等的顯著提高,而突變株NCU06487 (cea-1)、NCU 10006 (cea-2)的蛋白產(chǎn)量及內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶酶活均比野生型有65%-80%不等的顯著降低。為了進(jìn)一步研究這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在纖維素酶表達(dá)過(guò)程中的功能,首先,對(duì)突變株△cea-1和△cea-2進(jìn)行了回補(bǔ)實(shí)驗(yàn),證實(shí)了突變株蛋白和酶活的降低是由這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因缺失所引起的。同時(shí),亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)顯示這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子均定位于細(xì)胞核中。此外,△cea-1和△cea-2在纖維素條件下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示,由于cea-1和cea-2的缺失,大多數(shù)的纖維素酶基因明顯下調(diào)。而且,這兩轉(zhuǎn)錄因子的敲除顯著影響纖維素酶表達(dá)調(diào)控因子(Clr-1、Clr-2)、碳代謝阻遏因子CRE-1等已知重要轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平。在野生型菌株背景下過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明提高cea-1和cea-2的表達(dá)水平可以顯著提高蛋白產(chǎn)量和纖維素酶酶活。綜上所述,轉(zhuǎn)錄因子cea-1和cea-2是調(diào)控纖維素酶基因表達(dá)的重要中樞調(diào)控因子。這兩個(gè)新型纖維素酶表達(dá)調(diào)控因子的發(fā)現(xiàn)及功能的初步探索有助于進(jìn)一步闡明纖維素酶表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控機(jī)制,為高產(chǎn)纖維素酶工程菌株的構(gòu)建提供新素材和新思路。
【關(guān)鍵詞】：粗糙脈孢菌 轉(zhuǎn)錄因子 纖維素酶 鋅指蛋白 表達(dá)調(diào)控
【學(xué)位授予單位】：天津科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：TQ925
【目錄】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-8
• 1 前言8-18
• 1.1 木質(zhì)纖維素降解8-13
• 1.1.1 纖維素酶系組成和作用方式8-9
• 1.1.2 纖維素酶誘導(dǎo)機(jī)制9-10
• 1.1.3 纖維素酶表達(dá)調(diào)控機(jī)制10-13
• 1.2 粗糙脈孢菌概述13-16
• 1.2.1 粗糙脈孢菌的基本特征13-15
• 1.2.2 粗糙脈孢菌在生物能源領(lǐng)域研究現(xiàn)狀15-16
• 1.3 課題立項(xiàng)依據(jù)及目的意義16-18
• 1.3.1 課題立項(xiàng)依據(jù)16-17
• 1.3.2 課題研究意義17-18
• 2 材料與方法18-32
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料18-21
• 2.1.1 菌株18-19
• 2.1.2 質(zhì)粒19-20
• 2.1.3 培養(yǎng)基20-21
• 2.2 儀器和試劑21-26
• 2.2.1 儀器21
• 2.2.2 試劑21-22
• 2.2.3 PCR引物22-26
• 2.3 分子生物學(xué)操作方法26-29
• 2.3.1 PCR反應(yīng)26
• 2.3.2 瓊脂糖凝膠電泳26
• 2.3.3 質(zhì)粒提取26-27
• 2.3.4 酶切反應(yīng)27
• 2.3.5 連接反應(yīng)27
• 2.3.6 瓊脂糖凝膠切膠回收27
• 2.3.7 大腸桿菌轉(zhuǎn)化27-28
• 2.3.8 SDS-PAGE電泳28
• 2.3.9 粗糙脈孢菌基因組提取28
• 2.3.10 粗糙脈孢菌RNA提取與純化28-29
• 2.3.11 熒光定量PCR29
• 2.4 粗糙脈孢菌有性雜交29
• 2.5 粗糙脈孢菌轉(zhuǎn)化29-30
• 2.6 搖瓶發(fā)酵30
• 2.7 蛋白及酶活測(cè)定30-31
• 2.7.1 蛋白測(cè)定30
• 2.7.2 酶活測(cè)定30-31
• 2.8 生物量測(cè)定31-32
• 3 結(jié)果與討論32-54
• 3.1 C_2H_2家族突變體庫(kù)篩選32-42
• 3.1.1 C_2H_2家族突變株的鑒定與保藏32-35
• 3.1.2 C_2H_2家族突變株蛋白及酶活測(cè)定35-37
• 3.1.3 突變株復(fù)篩驗(yàn)證37-42
• 3.2 CEA-1和CEA-2轉(zhuǎn)錄因子在纖維素酶表達(dá)調(diào)控中的功能研究42-54
• 3.2.1 △cea-1和△cea-2回補(bǔ)菌株構(gòu)建及表征42-44
• 3.2.2 轉(zhuǎn)錄因子CEA-1和CEA-2過(guò)表達(dá)菌株構(gòu)建及表征44-47
• 3.2.3 CEA-1和CEA-2在細(xì)胞中的定位47-48
• 3.2.4 轉(zhuǎn)錄因子CEA-1和CEA-2在纖維素酶表達(dá)調(diào)控中的作用48-53
• 3.2.5 小結(jié)53-54
• 4 結(jié)論54-56
• 5 展望56-57
• 6 參考文獻(xiàn)57-64
• 7 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文情況64-65
• 8 致謝65-66
• 附錄66

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