本文關(guān)鍵詞：南極喬治王島陸地和潮間帶放線菌多樣性研究

  更多相關(guān)文章： 南極喬治王島 放線菌 DGGE 16S rDNA克隆文庫(kù) 純培養(yǎng) 多樣性

【摘要】：南極喬治王島位于南極洲的低緯地區(qū),因處在南極半島與南美大陸間的多氣旋地帶,具有復(fù)雜多變的氣候環(huán)境特征,生態(tài)環(huán)境和生物群落對(duì)區(qū)域性或全球性氣候環(huán)境變化具有敏感性,是研究南極陸地和近岸海域生態(tài)系統(tǒng)的理想場(chǎng)所。作為微生物的一大類群,南極環(huán)境中的放線菌在長(zhǎng)期適應(yīng)這一特殊地理環(huán)境的過程中,可能會(huì)形成獨(dú)特的適應(yīng)模式以及分子調(diào)節(jié)機(jī)制,從而產(chǎn)生物種的新穎性和多樣性,其所蘊(yùn)含的應(yīng)用潛力巨大,受到國(guó)內(nèi)外微生物研究學(xué)者的高度重視。本文利用PCR-DGGE技術(shù)、16S rDNA克隆文庫(kù)技術(shù)和純培養(yǎng)技術(shù)對(duì)南極喬治王島陸地土壤和潮間帶底泥放線菌的多樣性進(jìn)行了研究,為有效開發(fā)利用特有南極放線菌資源奠定基礎(chǔ)。首先利用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)南極喬治王島陸地土壤和潮間帶底泥共12個(gè)樣品中放線菌的多樣性和群落結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行初步研究。從DGGE圖譜中條帶的多少及條帶測(cè)序結(jié)果可以看出南極喬治王島陸地土壤和潮間帶底泥中蘊(yùn)含豐富的放線菌資源,其中陸地土壤樣品中放線菌的多樣性要高于潮間帶底泥樣品中放線菌的多樣性。測(cè)序結(jié)果顯示,陸地土壤樣品中的30個(gè)條帶分布于放線菌綱(Actinobacteria)、酸微菌綱(Acidimicrobiia)和紅椿桿菌綱(Coriobacteriia)3個(gè)綱中的10個(gè)目、15個(gè)科中,其中放線菌綱中的假諾卡氏菌科(Pseudonocardiaceae)的條帶數(shù)最多,是該區(qū)域的優(yōu)勢(shì)菌群；潮間帶底泥樣品中的14個(gè)條帶分布于放線菌綱和酸微菌綱2個(gè)綱中的5個(gè)目、5個(gè)科中,放線菌綱中的去甲基醌菌科(Demequinaceae)數(shù)量最多,為優(yōu)勢(shì)菌群。構(gòu)建了4個(gè)放線菌16S rDNA克隆文庫(kù),對(duì)這12個(gè)樣品中放線菌的多樣性及群落結(jié)構(gòu)做進(jìn)一步分析。16S rDNA序列的測(cè)序結(jié)果表明,南極喬治王島陸地土壤和潮間帶底泥環(huán)境中蘊(yùn)涵著豐富且多樣的放線菌資源,而且陸地土壤中放線菌的多樣性要高于潮間帶底泥中放線菌的多樣性。兩個(gè)陸地土壤樣品的16SrDNA克隆文庫(kù)陸2和陸4中獲得的放線菌均分布于放線菌綱和酸微菌綱的10個(gè)目、16個(gè)科中,這6個(gè)陸地土壤樣品中共包含了10個(gè)目、19個(gè)科,其中放線菌綱占優(yōu)勢(shì)；潮間帶底泥樣品的2個(gè)16S rDNA克隆文庫(kù)中放線菌的多樣性相對(duì)較低,分布于放線菌綱和酸微菌綱的8個(gè)目、14個(gè)科中,其中E5和E8混合樣品中獲得的放線菌分布于5個(gè)目、8個(gè)科中；E1、E11、W3和W4混合樣品中的放線菌分布于7個(gè)目、13個(gè)科中,這2個(gè)文庫(kù)中均是酸微菌綱占優(yōu)勢(shì)。將不同分類單元的代表序列與最大已知同源性序列構(gòu)建N-J系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,發(fā)現(xiàn)很多序列形成獨(dú)立的分支,與已知的同源性最大的菌株序列遺傳距離較遠(yuǎn),表明南極喬治王島陸地和潮間帶環(huán)境中蘊(yùn)藏著大量的放線菌新類群。利用11種不同的培養(yǎng)基對(duì)南極喬治王島陸地土壤和潮間帶底泥共30個(gè)樣品進(jìn)行放線菌的分離純化,共分離得到234株放線菌,經(jīng)過表觀排重后選取代表菌株進(jìn)行16S rDNA全長(zhǎng)序列測(cè)定并進(jìn)行Blast比對(duì),結(jié)果顯示這些菌株分別屬于放線菌綱的5個(gè)目,共9個(gè)屬25個(gè)不同的種,以Streptomyces、 Arthrobacter和Nocardiopsis屬菌株居多,其余均為稀有菌屬：Tsukamurella、 Nesterenkonia、Pseudonocardia、Microbacterium、Kocuria和Mircrococcus,其中從陸地士壤17個(gè)樣品中分離得到的143株放線菌屬于放線菌綱的7個(gè)屬、17個(gè)種;潮間帶底泥13個(gè)樣品中分離得到的91株放線菌屬于放線菌綱的5個(gè)屬、10個(gè)種。純培養(yǎng)結(jié)果再次表明南極喬治王島陸地和潮間帶環(huán)境中蘊(yùn)藏著豐富的放線菌資源,陸地土壤中放線菌的多樣性要高于潮間帶底泥中放線菌的多樣性。
【關(guān)鍵詞】：南極喬治王島 放線菌 DGGE 16S rDNA克隆文庫(kù) 純培養(yǎng) 多樣性
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q939.132
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第一章 前言12-23
• 1.1 放線菌概述及研究意義12-13
• 1.1.1 放線菌概述12-13
• 1.1.2 放線菌研究的意義13
• 1.2 南極地區(qū)放線菌研究概況及研究意義13-15
• 1.2.1 南極及南極喬治王島概述13-14
• 1.2.2 極地放線菌研究概況14-15
• 1.3 微生物多樣性研究技術(shù)15-22
• 1.3.1 傳統(tǒng)的研究方法15-17
• 1.3.2 分子生物學(xué)方法17-22
• 1.4 本論文研究的目的及意義22-23
• 第二章 DGGE技術(shù)分析南極喬治王島陸地和潮間帶放線菌多樣性23-45
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料23-25
• 2.1.1 樣品23-24
• 2.1.2 主要試劑和儀器24-25
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法25-33
• 2.2.1 樣品總DNA的提取(強(qiáng)力土壤DNA提取試劑盒)25-26
• 2.2.2 放線菌門特異性引物擴(kuò)增及純化26-28
• 2.2.3 V3高變區(qū)特異性引物擴(kuò)增28-29
• 2.2.4 DGGE電泳、切膠回收、擴(kuò)增并克隆測(cè)序29-33
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析33-44
• 2.3.1 引物的選擇及陽(yáng)性對(duì)照的設(shè)計(jì)33-34
• 2.3.2 樣品總DNA的提取34
• 2.3.3 放線菌門特異性引物擴(kuò)增34-35
• 2.3.4 V3高變區(qū)特異性引物擴(kuò)增35
• 2.3.5 DGGE電泳、切膠回收、擴(kuò)增并克隆測(cè)序35-36
• 2.3.6 DGGE技術(shù)分析南極喬治王島陸地和潮間帶放線菌多樣性36-43
• 2.3.7 南極喬治王島陸地和潮間帶樣品中放線菌多樣性比較及分析43-44
• 2.4 本章小結(jié)44-45
• 第三章 16S rDNA文庫(kù)技術(shù)分析南極喬治王島陸地和潮間帶放線菌多樣性45-75
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料45-47
• 3.1.1 樣品45-46
• 3.1.2 主要試劑和儀器46-47
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法47-50
• 3.2.1 樣品總DNA的提取47
• 3.2.2 放線菌門特異性引物擴(kuò)增及純化47
• 3.2.3 16S rDNA序列的克隆與測(cè)序47-48
• 3.2.4 16S rDNA克隆文庫(kù)的系統(tǒng)發(fā)育及多樣性分析48-50
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析50-73
• 3.3.1 樣品總DNA的提取50
• 3.3.2 放線菌門特異性引物擴(kuò)增50-51
• 3.3.3 16S rDNA克隆文庫(kù)的構(gòu)建及RFLP分析51-52
• 3.3.4 16S rDNA克隆文庫(kù)的多樣性指數(shù)分析及稀有度曲線52-54
• 3.3.5 16S rDNA克隆文庫(kù)的多樣性及系統(tǒng)發(fā)育分析54-72
• 3.3.6 南極喬治王島陸地和潮間帶樣品中放線菌多樣性比較及分析72-73
• 3.5 本章小結(jié)73-75
• 第四章 純培養(yǎng)技術(shù)分析南極喬治王島陸地和潮間帶放線菌多樣性75-97
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料75-79
• 4.1.1 樣品75-76
• 4.1.2 主要試劑和儀器76-77
• 4.1.3 培養(yǎng)基77-79
• 4.1.4 主要引物79
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法79-82
• 4.2.1 放線菌的分離培養(yǎng)79-80
• 4.2.2 菌株的純化及保藏80
• 4.2.3 放線菌菌株基因組DNA的提取80-81
• 4.2.4 菌株16S rDNA的擴(kuò)增81
• 4.2.5 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化81-82
• 4.2.6 序列的克隆及測(cè)序82
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果82-91
• 4.3.1 南極喬治王島陸地土壤和潮間帶底泥樣品放線菌的分離純化82-86
• 4.3.2 放線菌菌株基因組DNA的提取86
• 4.3.3 南極喬治王島陸地和潮間帶放線菌菌株16S rDNA的擴(kuò)增86-87
• 4.3.4 南極喬治王島陸地土壤和潮間帶底泥樣品中放線菌菌株多樣性分析87-89
• 4.3.5 16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建與分析89-91
• 4.4 免培養(yǎng)與純培養(yǎng)分析放線菌多樣性比較91-96
• 4.5 本章小結(jié)96-97
• 論文總結(jié)97-100
• 研究展望100-101
• 參考文獻(xiàn)101-107
• 致謝107-108
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷108-109
• 發(fā)表的學(xué)術(shù)論文109

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