本文關鍵詞：As-Kip2在中國鹵蟲滯育胚胎重啟動過程中的作用

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【摘要】：中國鹵蟲(Artemia Sinica)又稱為鹽水豐年蟲、鹽水豐年蝦等。屬于節(jié)肢動物門(Arthropoda),甲殼綱(Crustacea),鰓足亞綱(Branchiopoda),無甲目(Anostaca),鹵蟲科(Artemiidae),鹵蟲屬(Artemia)。鹵蟲是一種世界性分布的廣溫耐高鹽的甲殼動物,廣泛分布于內(nèi)陸鹽湖和海岸鹽田中。在環(huán)境條件脅迫下,鹵蟲胚胎進入滯育階段,如遇合適條件即可解除滯育重新啟動發(fā)育,但其滯育胚胎重啟動的分子機制一直沒有研究清楚。Kip2又可稱作p57Kip2、CDKI1C,屬于細胞周期依賴激酶抑制因子(cyclin dependent kinases inhibitor,CDKI),是Cip/Kip家族的成員之一,是細胞周期的負調(diào)控蛋白。CDKI能夠競爭性地與細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin dependent kinases,CDK)結(jié)合抑制其活性,使細胞周期停滯在G1期,從而實現(xiàn)對細胞周期的調(diào)節(jié)。本實驗以中國鹵蟲為實驗材料,利用分子生物學技術(shù),首次克隆了As-Kip2基因,獲得了1023bp的As-Kip2基因cDNA全序列。通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn),該基因包含一個492bp的開放閱讀框,編碼一個由163個氨基酸組成的蛋白。此蛋白的分子量大約為18.7kDa,等電點為9.45,具有一個CDI結(jié)構(gòu)域。預測該蛋白有15個磷酸化位點,為疏水性蛋白,無信號肽,無跨膜結(jié)構(gòu)域。用Real-time qPCR技術(shù),對As-Kip2在中國鹵蟲各發(fā)育時期、鹽刺激、低溫刺激時的表達量分別進行研究。發(fā)現(xiàn)As-Kip2隨著發(fā)育的進行表達量逐漸增加,在低溫及高鹽等惡劣條件下表達量較高。推測這是因為在發(fā)育后期,低溫和高鹽條件時,As-Kip2使細胞周期停滯在G1期,細胞分裂和分化逐漸減慢。在環(huán)境條件脅迫下,鹵蟲胚胎進入滯育階段。如遇合適條件,如適宜溫度、鹽度時,As-Kip2表達量下降,細胞周期正常進行,滯育解除重新啟動發(fā)育。在利用原位雜交技術(shù),對As-Kip2在鹵蟲發(fā)育各時期表達部位進行研究,發(fā)現(xiàn)As-Kip2在鹵蟲各時期各部位均有表達。利用Western blotting技術(shù),在蛋白水平上研究As-Kip2蛋白在中國鹵蟲個發(fā)育時期、鹽刺激、低溫刺激時的表達量,發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)育的進行,溫度逐漸降低,鹽度逐漸升高,As-Kip2蛋白表達量逐漸增加,這與Real-time qPCR的結(jié)果相似,同時證明了該實驗結(jié)果的可信性。該研究分析了As-Kip2在中國鹵蟲胚胎發(fā)育過程的表達模式,從而闡述了As-Kip2在鹵蟲發(fā)育階段對細胞周期的調(diào)控及在鹵蟲滯育卵重新發(fā)育過程中的關鍵作用,為進一步研究滯育的形成及解除以及Kip2在脊椎動物中的深入研究提供了理論基礎。
【關鍵詞】：中國鹵蟲 Kip2基因 滯育
【學位授予單位】：遼寧師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q954.4
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-7
• 1 前言7-13
• 1.1 鹵蟲研究概述7-9
• 1.1.1 鹵蟲的形態(tài)特征7-8
• 1.1.2 鹵蟲的生活史8-9
• 1.2 Kip2基因的結(jié)構(gòu)、功能及表達部位9-13
• 1.2.1 Kip2的結(jié)構(gòu)9
• 1.2.2 Kip2的功能9-13
• 1.2.3 Kip2表達部位13
• 1.3 本研究的目的及意義13
• 2.實驗材料及實驗方法13-35
• 2.1 實驗材料13-17
• 2.1.1 鹵蟲的培養(yǎng)13-14
• 2.1.2 主要儀器與設備14
• 2.1.3 實驗主要試劑14-17
• 2.2 實驗方法17-35
• 2.2.1 鹵蟲各時期總RNA的提取17
• 2.2.2 反轉(zhuǎn)錄cDNA17-18
• 2.2.3 PCR擴增18-23
• 2.2.4 As-Kip2的生物信息學分析23
• 2.2.5 實時定量PCR23-25
• 2.2.6 切片原位雜交25-28
• 2.2.7 原核表達28-33
• 2.2.8 免疫印跡試驗33-35
• 3.實驗結(jié)果35-49
• 3.1 As-Kip2 EST的獲得35
• 3.2 RACE技術(shù)獲得As-Kip2全序列35-37
• 3.3 信息學分析37-42
• 3.4 As-Kip2的表達模式42-44
• 3.4.1 As-Kip2在中國鹵蟲胚胎發(fā)育各時期的表達模式42-43
• 3.4.2 As-Kip2在鹽脅迫時的表達模式43-44
• 3.4.3 As-Kip2在低溫脅迫時的表達模式44
• 3.5 As-Kip基因在鹵蟲胚胎發(fā)育過程中的表達部位分析44-45
• 3.6 As-KIP2蛋白重組及原核表達45-47
• 3.7 Western Blotting47-49
• 3.7.1 As-KIP2蛋白在鹵蟲胚胎發(fā)育不同時期表達模式分析47-48
• 3.7.2 As-KIP2蛋白在鹽刺激下表達模式分析48
• 3.7.3 As-KIP2蛋白在鹽刺激下表達模式分析48-49
• 4.討論49-52
• 4.1 中國鹵蟲As-Kip2基因全長及結(jié)構(gòu)49-50
• 4.2 As-Kip2基因的表達模式50-51
• 4.2.1 As-Kip2基因不同時期的表達模式50
• 4.2.2 As-Kip2基因在鹽度刺激下的表達模式50-51
• 4.2.3 As-Kip2基因在低溫刺激下的表達模式51
• 4.3 As-Kip2基因在個發(fā)育階段的表達部位51-52
• 4.4 As-KIP2重組蛋白表達52
• 4.5 As-KIP2蛋白的表達量52
• 5 結(jié)論52-54
• 參考文獻54-57
• 致謝57

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1 周篤s，

本文編號：886038