本文關(guān)鍵詞：谷胱甘肽親和層析介質(zhì)制備及其對(duì)蛋白的純化

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【摘要】：谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶融合表達(dá)系統(tǒng)是通過(guò)大腸桿菌進(jìn)行蛋白表達(dá)、純化和檢測(cè)的重要系統(tǒng)。此系統(tǒng)表達(dá)的蛋白一般在N末端融合上可溶性谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶作為標(biāo)簽。由于谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶與谷胱甘肽能夠特異性的結(jié)合,因此可以通過(guò)谷胱甘肽親和層析介質(zhì)對(duì)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶融合蛋白進(jìn)行分離、富集和純化。以瓊脂糖凝膠4 FF為基質(zhì),1,4-丁二醇二縮水甘油醚為活化劑,通過(guò)活化、偶聯(lián)谷胱甘肽(GSH),優(yōu)化活化及偶聯(lián)條件,得到GSH親和層析介質(zhì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：活化及偶聯(lián)的優(yōu)化條件為10 mL基質(zhì)加入0.42gNaOH,15mLDMSO,15mLBDGE,反應(yīng)溫度為40℃,反應(yīng)時(shí)間為6 h。在此條件下,環(huán)氧基修飾密度可達(dá)60-65 μmol/mL;當(dāng)偶聯(lián)溶液pH 6.5時(shí),所制備的自制介質(zhì)載量可達(dá)14.19±0.98 mg/mL。以此介質(zhì)對(duì)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶及融合蛋白進(jìn)行純化,結(jié)果表明該介質(zhì)純化效果較好、穩(wěn)定性較搞,可重復(fù)使用。丙氨酸脫氫酶(alanine dehydrogenase, EC 1.4.1.1)是一種以煙酰胺腺嘌呤(NAD+)為輔酶的氨基酸脫氫酶,可逆催化丙氨酸的氧化脫氨反應(yīng)生成丙酮酸,氨以及NADH。晶體結(jié)構(gòu)解析酶蛋白空間結(jié)構(gòu)為深入闡述酶的催化機(jī)理提供更為有利的條件。本文以巨大芽孢桿菌WSH-002菌株(Bacillus. Megaterium WSH-002,GenBankNo.345442329)基因組為模版,將目的基因克隆到表達(dá)載體,得到重組質(zhì)粒pET-28a-Ald、 pGEX-6P-1/Ald,并分別轉(zhuǎn)入到BL21(DE3), IPTG低溫誘導(dǎo)后均為大量可溶性表達(dá)。菌體上清液分別經(jīng)商業(yè)鎳柱、自制GSH層析柱和尺寸排除色譜純化后均獲得高純度的Ald WSH-002蛋白。對(duì)高純度蛋白采用晶體生長(zhǎng)試劑盒篩選初步結(jié)晶條件并優(yōu)化。蛋白濃度為12 mg/mL,結(jié)晶溶液為0.03 M檸檬酸pH7.5,16%(w/v) PEG3350時(shí),晶體衍射率為2.22A屬于三方晶系；蛋白濃度15 mg/mL,結(jié)晶溶液為0.1M HEPES pH 8.0,12%(w/v) PEG 8000,8%(v/v) ethylene glycol,晶體衍射率為2.35A,屬三方晶系。
【關(guān)鍵詞】：谷胱甘肽親和層析 活化 載量 巨大芽孢桿菌WSH-002 丙氨酸脫氫酶 蛋白結(jié)晶 晶體結(jié)構(gòu)
【學(xué)位授予單位】：天津科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：Q503
【目錄】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-9
• 1 前言9-21
• 1.1 親和層析介質(zhì)9
• 1.2 谷胱甘肽親和層析介質(zhì)的特點(diǎn)9-10
• 1.3 谷胱甘肽親和層析介質(zhì)的研究進(jìn)展10-11
• 1.4 丙氨酸脫氫酶的分布11
• 1.5 丙氨酸脫氫酶的生物學(xué)功能11-12
• 1.6 丙氨酸脫氫酶的催化機(jī)理12-13
• 1.7 丙氨酸脫氫酶的結(jié)構(gòu)研究13-19
• 1.7.1 蛋白的表達(dá)13-14
• 1.7.2 蛋白的純化14-15
• 1.7.3 蛋白晶體的獲得15-18
• 1.7.4 晶體數(shù)據(jù)收集與處理18-19
• 1.7.5 丙氨酸脫氫酶的研究進(jìn)展19
• 1.8 論文立題的背景,內(nèi)容及意義19-21
• 1.8.1 論文立題背景19-20
• 1.8.2 研究?jī)?nèi)容及意義20-21
• 2 材料與方法21-39
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料21-28
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)常用生化試劑21-22
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器22-23
• 2.1.3 試劑盒、工具酶及分子量Marker23-24
• 2.1.4 緩沖液和常用培養(yǎng)基的配制24-27
• 2.1.5 丙氨酸脫氫酶基因及其他菌株來(lái)源27-28
• 2.1.6 表達(dá)宿主和載體28
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法28-39
• 2.2.1 瓊脂糖4 FF凝膠顆粒的活化28-29
• 2.2.2 活化的Sepharose 4 Fast Flow凝膠顆粒偶聯(lián)GSH29
• 2.2.3 終止偶聯(lián)反應(yīng)29
• 2.2.4 谷胱甘肽親和層析介質(zhì)的性能評(píng)價(jià)29-30
• 2.2.5 丙氨酸脫氫酶重組質(zhì)粒的構(gòu)建30-35
• 2.2.6 丙氨酸脫氫酶的表達(dá)純化35-37
• 2.2.7 丙氨酸脫氫酶結(jié)晶條件的初篩及優(yōu)化37
• 2.2.8 丙氨酸脫氫酶蛋白晶體數(shù)據(jù)收集與處理37-39
• 3 結(jié)果與討論39-56
• 3.1 瓊脂糖凝膠活化條件的優(yōu)化39-41
• 3.1.1 無(wú)水反應(yīng)體系對(duì)活化的影響39
• 3.1.2 溫度對(duì)活化的影響39-40
• 3.1.3 NaOH濃度對(duì)活化的影響40
• 3.1.4 活化時(shí)間的影響40-41
• 3.2 GSH偶聯(lián)的優(yōu)化41-42
• 3.3 GSH層析介質(zhì)性能42-45
• 3.3.1 穩(wěn)定性測(cè)試42-43
• 3.3.2 載量測(cè)試43-45
• 3.3.3 與GE介質(zhì)層析效果對(duì)照45
• 3.4 丙氨酸脫氫酶Ald_WSH-002重組質(zhì)粒的構(gòu)建45-47
• 3.4.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定45-46
• 3.4.2 Ald_BM WSH-002重組質(zhì)粒的鑒定46-47
• 3.4.3 Ald_WSH-002重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果47
• 3.5 丙氨酸脫氫酶Ald_WSH-002的表達(dá)純化47-50
• 3.5.1 試表達(dá)47-48
• 3.5.2 擴(kuò)大化表達(dá)及純化48-50
• 3.6 丙氨酸脫氫酶Ald_WSH-002結(jié)晶條件的篩選及優(yōu)化50-51
• 3.6.1 蛋白結(jié)晶條件的初步篩選50
• 3.6.2 蛋白晶體的優(yōu)化50-51
• 3.7 丙氨酸脫氫酶Ald_WSH-002蛋白晶體衍射數(shù)據(jù)收集與處理51-53
• 3.8 丙氨酸脫氫酶Ald_WSH-002蛋白的結(jié)構(gòu)解析53-56
• 3.8.1 Ald_WSH-002蛋白的結(jié)構(gòu)53
• 3.8.2 與其他丙氨酸脫氫酶氨基酸序列比對(duì)及結(jié)構(gòu)比較53-54
• 3.8.3 Ald蛋白活性區(qū)域54-56
• 4 結(jié)論56-57
• 5 展望57-58
• 6 參考文獻(xiàn)58-64
• 7 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文64-65
• 8 致謝65-66
• 附錄66-67

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本文編號(hào)：835080