本文關(guān)鍵詞：日本七鰓鰻Fyn-like的基因編碼區(qū)克隆、重組表達(dá)以及相關(guān)免疫學(xué)研究

  更多相關(guān)文章： 酪氨酸蛋白激酶Fyn-like 進(jìn)化 日本七鰓鰻 免疫應(yīng)答

【摘要】：Fyn基因是非受體型酪氨酸蛋白激酶Src家族成員之一,在細(xì)胞的生長(zhǎng)、生存、凋亡、細(xì)胞與細(xì)胞之間的粘附以及免疫應(yīng)答作用方面起到十分重要的作用。七鰓鰻是具有很高研究?jī)r(jià)值的模式生物,因?yàn)樗窃谶M(jìn)化上連接脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物的最原始的無頜類脊椎動(dòng)物。同時(shí),它不僅有固有免疫系統(tǒng),還具有適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。在目前的研究中,對(duì)七鰓鰻的免疫系統(tǒng)的研究一直是當(dāng)今的熱點(diǎn)。本研究在七鰓鰻中首次發(fā)現(xiàn)了Fyn-like基因,并對(duì)Fyn-like基因的cDNA進(jìn)行了克隆。Fyn-like的ORF區(qū)全長(zhǎng)1611bp,編碼537個(gè)氨基酸,3’UTR區(qū)1424bp。通過blast序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn),它與SRC家族的成員(Yes、Src和Fyn)的同源性都很高。為了說明Fyn-like基因的進(jìn)化關(guān)系,從基因數(shù)據(jù)庫中找出從無頜類到哺乳類動(dòng)物的Fyn、Yes和Src基因序列進(jìn)行系譜分析,進(jìn)一步證實(shí)了所克隆得到的基因序列為Fyn-like。目前為止,發(fā)現(xiàn)Fyn-like基因從無頜類中首次被發(fā)現(xiàn)。對(duì)其保守性進(jìn)行分析,結(jié)果表明Fyn-like基因同樣包含了三個(gè)保守結(jié)構(gòu)域,分別為Src同源結(jié)構(gòu)域3(SH3)、Src同源結(jié)構(gòu)域2(SH2)和激酶結(jié)構(gòu)域(PKc)。通過實(shí)時(shí)定量PCR和免疫印跡實(shí)驗(yàn)分別從基因水平和蛋白水平來檢測(cè)Fyn-like在七鰓鰻各個(gè)組織(白細(xì)胞、脂肪體、鰓、腎、心)中的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),用混合菌刺激后,發(fā)現(xiàn)在腮組織和白細(xì)胞中表達(dá)量明顯上調(diào),這個(gè)結(jié)果說明,酪氨酸蛋白激酶Fyn很可能參與免疫應(yīng)答。免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),Fyn-like蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)中,這可能還與它參與體內(nèi)多條信號(hào)通路、調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)功能相關(guān)。我們也分時(shí)段檢測(cè)了鰓組織中免疫后的Fyn-like蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在加強(qiáng)免疫后的16h時(shí),Fyn-like蛋白的表達(dá)量最高,隨后會(huì)逐漸減少。同時(shí),此次研究也可以為之后研究SRC家族激酶之間的進(jìn)化關(guān)系提供必要的基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：酪氨酸蛋白激酶Fyn-like 進(jìn)化 日本七鰓鰻 免疫應(yīng)答
【學(xué)位授予單位】：遼寧師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q78
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 1 緒論9-16
• 1.1 Fyn的發(fā)現(xiàn)9
• 1.2 Fyn的結(jié)構(gòu)9-10
• 1.3 Fyn的膜定位方式10-11
• 1.4 Fyn的活化過程11-12
• 1.5 Fyn的主要功能12-15
• 1.5.1 Fyn對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的影響12-13
• 1.5.2 Fyn對(duì)T細(xì)胞發(fā)育的影響13-14
• 1.5.3 Fyn與T細(xì)胞受體的相互作用14-15
• 1.6 展望15-16
• 2 日本七鰓鰻Fyn-like基因的分子克隆16-27
• 2.1 材料16
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料16
• 2.1.2 儀器設(shè)備16
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑16
• 2.2 方法16-23
• 2.2.1 引物設(shè)計(jì)16-17
• 2.2.2cDNA模板的制備17-19
• 2.2.3 PCR擴(kuò)增19-21
• 2.2.4 目的片段切膠回收21
• 2.2.5 末端加A處理21-22
• 2.2.6 目的片段與載體連接22
• 2.2.7 轉(zhuǎn)化22
• 2.2.8 檢菌、接菌、質(zhì)粒提取22-23
• 2.3 結(jié)果23-26
• 2.3.1 髓樣小體總RNA的提取及模板檢驗(yàn)23
• 2.3.2 基因克隆23-26
• 2.4 討論26
• 2.5 小結(jié)26-27
• 3 日本七鰓鰻Fyn-like基因生物信息學(xué)的分析27-34
• 3.1 所用到的在線網(wǎng)站及軟件27
• 3.2 結(jié)果27-33
• 3.2.1 一級(jí)結(jié)構(gòu)分析27
• 3.2.2 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)27-28
• 3.2.3 抗原表位及疏水性的分析28-29
• 3.2.4 同源序列比對(duì)29-31
• 3.2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析31-33
• 3.3 討論33
• 3.4 小結(jié)33-34
• 4 日本七鰓鰻Fyn-like蛋白表達(dá)、純化和抗體的檢測(cè)34-41
• 4.1 材料與方法34-37
• 4.1.1 引物設(shè)計(jì)34
• 4.1.2 表達(dá)載體的構(gòu)建34-35
• 4.1.3 陽性重組子的誘導(dǎo)35-36
• 4.1.4 融合蛋白的大量誘導(dǎo)表達(dá)36
• 4.1.5 重組蛋白的純化36-37
• 4.2 結(jié)果37-40
• 4.2.1 Lj-Fyn-like表達(dá)載體的構(gòu)建37-39
• 4.2.2 Lj-Fyn-like蛋白的表達(dá)、純化和anti-Yes抗體的檢測(cè)39-40
• 4.3 討論40
• 4.4 小結(jié)40-41
• 5 Fyn-like在組織中的表達(dá)及相關(guān)免疫學(xué)研究41-55
• 5.1 應(yīng)用qPCR方法檢測(cè)日本七鰓鰻Fyn-like基因在成體組織中的表達(dá)；41-43
• 5.1.1 材料和方法41
• 5.1.2 結(jié)果41-43
• 5.1.3 討論43
• 5.1.4 小結(jié)43
• 5.2 應(yīng)用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)Lj-Fyn-like蛋白在成體組織中的表達(dá)43-50
• 5.2.1 材料和方法43-47
• 5.2.2 結(jié)果47-49
• 5.2.3 討論49
• 5.2.4 小結(jié)49-50
• 5.3 日本七鰓鰻Fyn-like蛋白在鰓組織和白細(xì)胞中的定位與分布50-52
• 5.3.1 材料和方法50
• 5.3.2 結(jié)果50-52
• 5.3.3 討論52
• 5.3.4 小結(jié)52
• 5.4 日本七鰓鰻Fyn-like蛋白在鰓組織中的表達(dá)時(shí)效52-55
• 5.4.1 材料和方法52-53
• 5.4.2 結(jié)果53-54
• 5.4.3 討論54
• 5.4.4 小結(jié)54-55
• 6 結(jié)論55-56
• 6.1 主要結(jié)論55
• 6.2 創(chuàng)新點(diǎn)55-56
• 參考文獻(xiàn)56-60
• 附錄A 不同物種的Fyn、Yes、Src的FASTA格式氨基酸序列60-69
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文情況69-70
• 致謝70

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