本文關(guān)鍵詞：ocnus敲降對(duì)果蠅育性的影響

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【摘要】：Wolbachia是一種革蘭氏陰性菌,普遍存在于節(jié)肢動(dòng)物體內(nèi),通過(guò)母系遺傳調(diào)控宿主生殖方面的變化,其中細(xì)胞質(zhì)不親和(cytoplasmic incompatibility,CI)是最常見(jiàn)的研究最多的表型,除此以外,還有孤雌生殖、雌性化和殺雄等生殖方面的變化。在果蠅中,感染W(wǎng)olbachia的雄性果蠅與未感染或者感染不同Wolbachia品系的雌性果蠅進(jìn)行交配時(shí),后代胚胎成活率降低或僅有少量后代的現(xiàn)象,叫做細(xì)胞質(zhì)不親和(CI)。細(xì)胞質(zhì)不親和導(dǎo)致受精卵在第一次有絲分裂時(shí)雄性原核發(fā)育速度低于雌性原核發(fā)育速度,在分裂時(shí)形成染色質(zhì)間橋,第一次有絲分裂失敗,導(dǎo)致胚胎死亡。盡管有研究表明,Wolbachia可能對(duì)宿主的精子產(chǎn)生了修飾作用,但有關(guān)Wolbachia誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)不親和的分子機(jī)制還不是很清楚。本課題組前期通過(guò)microarry技術(shù)檢測(cè)了未感染和感染W(wǎng)olbachia的三齡幼蟲(chóng)精巢中基因表達(dá)情況,鑒定到許多差異表達(dá)(上調(diào)和下調(diào))的基因,其中包括ocnus(ocn)。本研究首先通過(guò)RT-PCR (qRT-PCR)的方法,進(jìn)一步檢測(cè)了Wolbachia的感染果蠅精巢中ocn表達(dá)的影響,結(jié)果顯示,Wolbachia感染導(dǎo)致1日齡果蠅精巢中ocn表達(dá)量極顯著下調(diào)(p0.01),說(shuō)明ocn可能與雄性果蠅的繁殖有關(guān)。已有研究認(rèn)為,ocn在精巢中特異表達(dá),暗示ocn可能對(duì)雄性繁殖起重要作用。有關(guān)ocn在果蠅繁殖過(guò)程中的具體作用還未見(jiàn)報(bào)道。為了進(jìn)一步研究ocnus的功能,我們采用UAS-RNAi/Ga14系統(tǒng),研究ocn敲降對(duì)果蠅繁殖的影響。我們分別用NosGa14和BamGa14驅(qū)動(dòng)ocn在生殖腺和精巢中特異敲降,qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),無(wú)論是用NosGa14還是BamGa14驅(qū)動(dòng),都使得1日齡敲降雄蠅體內(nèi)ocn的表達(dá)量與對(duì)照組相比有極顯著下調(diào)(p0.01),說(shuō)明敲降效果好。為了研究ocn基因敲降對(duì)雄果蠅繁殖的影響,我們用兩種方法敲降的1日齡雄果蠅(NosGa14; ocn-hp和BamGa14; ocn-hp)與正常處女蠅交配,統(tǒng)計(jì)子代的胚胎孵化率。結(jié)果顯示,兩種方法敲降的雄果蠅的子代胚胎孵化率極顯著低于對(duì)照組(NosGa14; W-和BamGal4;W-)(p0.01),說(shuō)明ocn在精巢中敲降嚴(yán)重?fù)p傷了雄性果蠅的繁殖力。為了研究ocn在精巢中對(duì)精子發(fā)生的影響,我們對(duì)實(shí)驗(yàn)組NosGa14; ocn-hp和BamGal4; ocn-hp與對(duì)照組的一日齡雄蠅精巢進(jìn)行DAPI染色,熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,精巢明顯變小,精巢頂部變得狹窄,生殖干細(xì)胞分散,精巢中極少有精子發(fā)生過(guò)程中的包囊,也有極少的精子束,儲(chǔ)精囊中極少有成熟的精子。因此,ocn敲降嚴(yán)重影響精巢的發(fā)育和精子發(fā)生過(guò)程。這可能是導(dǎo)致子代胚胎孵化率極顯著下降的原因之一。由于ocn在雄性果蠅中表達(dá)量特別高,為了研究其是否對(duì)雄性果蠅的求偶交配行為產(chǎn)生影響,我們對(duì)敲降雄蠅的交配活力進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明,在實(shí)驗(yàn)的30min內(nèi),NosGal4;ocn-hp和BamGal4;ocn-hp雄果蠅與正常雌果蠅(Dmel wMel T)發(fā)生交配的比率與對(duì)照組相比有顯著減少,且交配的持續(xù)時(shí)間也有顯著縮短,說(shuō)明ocn敲降也影響雄蠅交配活力。由于嗅覺(jué)、運(yùn)動(dòng)能力等都會(huì)對(duì)交配活力產(chǎn)生影響,為研究ocn敲降組中果蠅交配活力下降到底是由運(yùn)動(dòng)能力減弱引起,還是由嗅覺(jué)反應(yīng)能力降低引起的,我們先采用食物陷阱的方法,對(duì)敲降雄蠅的嗅覺(jué)反應(yīng)能力進(jìn)行檢測(cè),捕獲實(shí)驗(yàn)顯示,與對(duì)照組相比,ocn敲降果蠅對(duì)食物陷阱反應(yīng)能力都有極顯著下降,相同的時(shí)間內(nèi)被捕獲的比例極顯著低于對(duì)照組(p0.01)。為明確ocn敲降的果蠅被食物陷阱捕獲比例降低是否與果蠅本身的運(yùn)動(dòng)能力下降有關(guān),我們又采用空陷阱和雌蠅陷阱分別對(duì)敲降雄蠅的活動(dòng)能力和對(duì)雌性果蠅分泌的性信息素的識(shí)別能力進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)NosGal4;ocn-hp 10日齡雄性果蠅的活動(dòng)能力和對(duì)雌蠅性信息素的識(shí)別能力與對(duì)照組相比,都顯著降低。最后我們又檢測(cè)了ocn敲降的果蠅中相關(guān)基因(嗅覺(jué)相關(guān)基因：PBP1、PBP2、PBP3、orco;運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因：mlc、fln、myo61F、how、mef2、 actn、Imd)的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),僅有運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因mlc2的表達(dá)量在ocn敲降雄蠅體內(nèi)顯著降低(p0.05),下調(diào)到原來(lái)的0.35倍。由于已有研究表明,在果蠅中,mlc2的突變嚴(yán)重破壞果蠅的飛行機(jī)制和“求愛(ài)歌”的頻率,因此,我們推測(cè),ocn敲降引起的雄性果蠅交配活力的降低可能是由mlc2下調(diào)后果蠅自身運(yùn)動(dòng)能力減弱導(dǎo)致的。我們也發(fā)現(xiàn),BamGal4;ocn-hp3-4日齡處女蠅雌蠅與Dmel wMel T1日齡雄蠅交配后,雌蠅產(chǎn)卵量明顯減少(p0.05)。所以,ocn的敲降也對(duì)雌性果蠅的繁殖力有影響。綜上所述,ocn不僅在果蠅精子發(fā)生過(guò)程中起重要作用,而且對(duì)果蠅的運(yùn)動(dòng)能力(交配行為)也有很大的影響。
【關(guān)鍵詞】：黑腹果蠅 ocnus 敲降 精子發(fā)生 運(yùn)動(dòng)能力 mlc2
【學(xué)位授予單位】：華中師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：Q965
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-12
• 1、前言12-22
• 1.1 Wolbachia與CI關(guān)系的概述12-13
• 1.2 果蠅精子發(fā)生13-19
• 1.2.1 果蠅精子發(fā)生過(guò)程13-14
• 1.2.2 果蠅精巢生殖干細(xì)胞中的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控14-17
• 1.2.3 果蠅精子發(fā)生過(guò)程相關(guān)基因研究概述17-19
• 1.3 mlc2基因研究進(jìn)展19-20
• 1.4 ocnus基因研究進(jìn)展20
• 1.5 本研究的目的與意義20-22
• 2、實(shí)驗(yàn)材料與方法22-29
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料22
• 2.2 主要儀器設(shè)備22-23
• 2.3 試驗(yàn)方法23-29
• 2.3.1 果蠅普通培養(yǎng)基的配置23
• 2.3.2 果蠅四環(huán)素培養(yǎng)基的配置23-24
• 2.3.3 胚胎收集盤(pán)培養(yǎng)基的配置24
• 2.3.4 果蠅中Wolbachia的檢測(cè)24
• 2.3.5 果蠅基因組DNA的提取24-25
• 2.3.6 果蠅RNA的提取25
• 2.3.7 DNA消化、RNA反轉(zhuǎn)錄25-26
• 2.3.8 果蠅精巢DAPI染色26-27
• 2.3.9 敲降雄蠅繁殖力的檢測(cè)27
• 2.3.10 敲降雄蠅性活力測(cè)定27
• 2.3.11 敲降雌蠅產(chǎn)卵量和胚胎孵化率的測(cè)定27
• 2.3.12 敲降雄蠅嗅覺(jué)反應(yīng)能力的測(cè)定27-29
• 3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析29-38
• 3.1 果蠅體內(nèi)Wolbachia的去除29
• 3.2 感染W(wǎng)olbachia的雄性果蠅中ocnus表達(dá)量下調(diào)29-30
• 3.3 NosGal4和BamGal4驅(qū)動(dòng)ocnus在雄果蠅中表達(dá)水平顯著下調(diào)30-31
• 3.4 ocnus敲降雄蠅的繁殖力的檢測(cè)31-32
• 3.5 ocnus基因敲降一日齡雄蠅精巢的DAPI染色32-33
• 3.6 ocnus敲降雄蠅的性活力下降33
• 3.7 ocnus敲降降低雄蠅嗅覺(jué)陷阱反應(yīng)能力33-34
• 3.8 ocnus敲降減弱雄蠅的自身運(yùn)動(dòng)能力和對(duì)雌蠅陷阱的反應(yīng)能力34-35
• 3.9 ocnus敲降導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因mlc2基因表達(dá)量顯著下調(diào)35-36
• 3.10 ocnus基因敲降對(duì)雌蠅產(chǎn)卵量及胚胎孵化率的影響36-37
• 3.11 ocnus全身廣泛敲降(ActGAl4)導(dǎo)致幼蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育受阻37-38
• 4、討論38-42
• 4.1 ocnus在生殖腺敲降(NosGal4)和在精巢中特異敲降(BamGal4)嚴(yán)重影響精子發(fā)生過(guò)程和精巢形狀大小38-39
• 4.2 ocnus敲降顯著減弱雄蠅交配活力39
• 4.3 ocnus敲降顯著減弱雄蠅自身運(yùn)動(dòng)能力和對(duì)雌蠅陷阱反應(yīng)能力39-41
• 4.4 ocnus全身廣泛敲降對(duì)幼蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育的影響41
• 4.5 ocnus敲降對(duì)雌蠅產(chǎn)卵量的影響41-42
• 參考文獻(xiàn)42-50
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文情況50-51
• 致謝51

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 侯明月;ocnus敲降對(duì)果蠅育性的影響[D];華中師范大學(xué);2015年

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本文編號(hào)：688027