本文關(guān)鍵詞：日本七鰓鰻Tec的基因編碼區(qū)克隆、重組表達(dá)及相關(guān)免疫學(xué)研究

  更多相關(guān)文章： 日本七鰓鰻 酪氨酸蛋白激酶Tec 分子進(jìn)化 免疫印跡

【摘要】：Tec酪氨酸蛋白激酶是一種非受體酪氨酸蛋白激酶,它是一種細(xì)胞質(zhì)蛋白,主要表達(dá)在免疫相關(guān)組織和肝細(xì)胞中,Tec參與G蛋白偶聯(lián)受體和白介素介導(dǎo)的信號通路,調(diào)節(jié)諸多生物進(jìn)程,而且還是T細(xì)胞受體信號重要的調(diào)節(jié)分子。本文實驗中,在七鰓鰻血液cDNA庫中成功克隆Tec ORF區(qū)序列。七鰓鰻Tec(Lja-Tec)序列包含1923bpORF區(qū),69bp 5’UTR區(qū)以及1037bp 3’UTR區(qū)。對其序列進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測,Tec氨基酸序列包含了PH結(jié)構(gòu)域、Btk結(jié)構(gòu)域、SH3結(jié)構(gòu)域、SH2結(jié)構(gòu)域和TKD激酶結(jié)構(gòu)域。而且,對Tec序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析,并選取24個物種從哺乳動物到無頜類動物建進(jìn)化樹,以及MEME軟件分析其進(jìn)化歷程。發(fā)現(xiàn)七鰓鰻Tec位于脊椎動物進(jìn)化的最低處,符合進(jìn)化規(guī)律。利用RT-PCR法檢測Tec基因水平上在七鰓鰻髓樣小體、鰓、白細(xì)胞、腎和心免疫相關(guān)組織中的分布情況,發(fā)現(xiàn)刺激后鰓和白細(xì)胞中Tec的轉(zhuǎn)錄情況明顯上調(diào)。同時,用western blot分析了Tec轉(zhuǎn)錄水平上七鰓鰻刺激前后在以上組織中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)刺激后白細(xì)胞的表達(dá)明顯上調(diào)。表明了Tec可能參與免疫應(yīng)答,在七鰓鰻適應(yīng)性免疫中起到重要作用。構(gòu)建了Pet32a(+)-Tec表達(dá)載體,轉(zhuǎn)入表達(dá)感受態(tài)E.coli BL21中進(jìn)行表達(dá),然后用0.1mmol/LIPTG、30?C誘導(dǎo)蛋白表達(dá),得到了重組蛋白Tec,超聲破碎后,Tec蛋白主要在沉淀中表達(dá),為不可溶蛋白。用包涵體純化方法,經(jīng)組氨酸親和層析純化后,得到純化的重組蛋白Tec。利用Tec抗體經(jīng)western blot鑒定Tec重組蛋白和天然蛋白,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Tec蛋白在七鰓鰻白細(xì)胞中混合菌刺激前后變化比較明顯。接著研究了免疫沉淀,檢測與Tec相互作用蛋白,結(jié)果還需進(jìn)一步驗證。免疫熒光檢測了Tec在白細(xì)胞中的定位,結(jié)果顯示Tec為胞質(zhì)蛋白。綜上所述,以上的研究在七鰓鰻Tec功能或免疫機(jī)制研究中提供了重要線索。
【關(guān)鍵詞】：日本七鰓鰻 酪氨酸蛋白激酶Tec 分子進(jìn)化 免疫印跡
【學(xué)位授予單位】：遼寧師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q78
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 第1章 文章綜述10-18
• 1.1 Tec的結(jié)構(gòu)10-11
• 1.2 Tec上游作用分子11-14
• 1.2.1 淋巴細(xì)胞表面抗原與Tec作用11-12
• 1.2.2 細(xì)胞因子受體與Tec作用12-13
• 1.2.3 異三聚體G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）與Tec作用13
• 1.2.4 整合素與Tec作用13
• 1.2.5 Tec激酶的負(fù)調(diào)控13-14
• 1.3 Tec下游作用分子14-15
• 1.3.1 Tec與PLC-γ2 作用15
• 1.3.2 Tec與支架蛋白BRDG1作用15
• 1.3.3 Tec與PI3-K的影響15
• 1.4 Tec在體內(nèi)的功能15-17
• 1.4.1 誘導(dǎo)Bcl-xl16
• 1.4.2 調(diào)節(jié)Rho16
• 1.4.3 調(diào)控c-fos轉(zhuǎn)錄16
• 1.4.4 與T細(xì)胞作用16-17
• 1.5 小結(jié)17-18
• 第2章 七鰓鰻Tec基因的分子克隆以及生物信息學(xué)分析18-40
• 2.1 七鰓鰻Tec基因的分子克隆18-28
• 2.1.1 材料18-19
• 2.1.2 方法19-25
• 2.1.2.1 七鰓鰻白細(xì)胞分離19
• 2.1.2.2 總RNA提取--Trizol法19
• 2.1.2.3 引物設(shè)計19-20
• 2.1.2.4 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）擴(kuò)增20-22
• 2.1.2.5 3′RACE擴(kuò)增反應(yīng)22-24
• 2.1.2.6 目的片段連接至載體并提質(zhì)粒測序24-25
• 2.1.3 結(jié)果25-28
• 2.1.3.1 總RNA提取--Trizol法25
• 2.1.3.2 檢測cDNA模板25-26
• 2.1.3.3 Tec基因編碼區(qū)擴(kuò)增26-28
• 2.2 七鰓鰻Tec基因氨基酸序列生物信息學(xué)分析28-39
• 2.2.1 軟件、在線網(wǎng)站和數(shù)據(jù)庫28-29
• 2.2.2 結(jié)果29-39
• 2.2.2.1 理化性質(zhì)分析29-30
• 2.2.2.2 同原序列比對30-32
• 2.2.2.3 信號肽預(yù)測32
• 2.2.2.4 跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測32-33
• 2.2.2.5 功能結(jié)構(gòu)預(yù)測33-34
• 2.2.2.6 二級結(jié)構(gòu)域預(yù)測34-35
• 2.2.2.7 三級結(jié)構(gòu)預(yù)測35
• 2.2.2.8 系統(tǒng)發(fā)育分析35-36
• 2.2.2.9 保守基序分析36-39
• 2.3 討論39
• 2.4 小結(jié)39-40
• 第3章 七鰓鰻Tec基因原核表達(dá)及蛋白純化40-52
• 3.1 材料40
• 3.2 方法40-46
• 3.2.1 引物設(shè)計40-41
• 3.2.2 PCR擴(kuò)增41-42
• 3.2.3 切膠回收42
• 3.2.4 目的片段與表達(dá)載體相連42
• 3.2.5 轉(zhuǎn)化42
• 3.2.6 陽性菌的鑒定42-43
• 3.2.7 Tec蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)43
• 3.2.8 SDS-PAGE鑒定43-44
• 3.2.9 重組蛋白的純化44-46
• 3.2.10 檢測重組蛋白濃度46
• 3.3 結(jié)果46-51
• 3.4 討論51
• 3.5 小結(jié)51-52
• 第4章 七鰓鰻Tec蛋白相關(guān)免疫學(xué)研究52-62
• 4.1 實時熒光定量PCR法檢測Tec的表達(dá)52-55
• 4.1.1 材料52-53
• 4.1.2 方法53-54
• 4.1.2.1 混合菌刺激53
• 4.1.2.2 分離七鰓鰻白細(xì)胞53
• 4.1.2.3 Total RNA提取53
• 4.1.2.4 RNA質(zhì)量檢測53
• 4.1.2.5 Real time PCR法檢測Tec在各組織的相對表達(dá)量53-54
• 4.1.3 結(jié)果54-55
• 4.2 免疫學(xué)鑒定55-60
• 4.2.1 材料55-56
• 4.2.2 方法56-57
• 4.2.2.1 western blot56
• 4.2.2.2 免疫沉淀56-57
• 4.2.2.3 免疫熒光57
• 4.2.3 結(jié)果57-60
• 4.3 討論60-61
• 4.4 小結(jié)61-62
• 結(jié)論62-63
• 本文創(chuàng)新點63-64
• 參考文獻(xiàn)64-67
• 附錄A 不同物種Tec基因的FASTA格式氨基酸序列67-76
• 附錄B Pet32a(+)質(zhì)粒圖譜76-77
• 附錄C 蛋白濃度測定標(biāo)準(zhǔn)曲線77-78
• 附錄D 重組蛋白Tec質(zhì)譜檢測結(jié)果78-79
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文情況79-80
• 致謝80

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