本文關(guān)鍵詞：類球紅細(xì)菌遺傳操作體系的構(gòu)建及其產(chǎn)輔酶Q10代謝工程研究

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【摘要】：輔酶Q10(CoQ10)是細(xì)胞有氧呼吸鏈電子傳遞鏈中重要的輔因子,由苯醌環(huán)母核和聚十疏水類異戊二烯鏈組成。輔酶Q 1 0通過抗氧化和清除自由基等特性保護(hù)機(jī)體器官和組織。廣泛應(yīng)用于食品營養(yǎng)添加、心血管疾病的治療和化妝品添加。由于輔酶Q10的大量需求,吸引了國內(nèi)外眾多的公司對其進(jìn)行商業(yè)開發(fā)。生產(chǎn)輔酶Q10的方法多種多樣,微生物發(fā)酵法是當(dāng)前最具前景的方法,但通過對微生物傳統(tǒng)的育種和發(fā)酵條件優(yōu)化己處瓶頸期。要實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn),對菌株進(jìn)行改造,獲得高產(chǎn)輔酶Q10菌株是首要解決的問題。本實(shí)驗(yàn)以高產(chǎn)輔酶Q10菌株之一類球紅細(xì)菌為研究對象,從改造其遺傳操作體系入手,再通過代謝工程和定向進(jìn)化的方式對類球紅細(xì)菌進(jìn)行改造,提高菌株產(chǎn)輔酶Q10能力。本研究的主要內(nèi)容分為以下幾部分：1、試圖對類球紅細(xì)菌進(jìn)行改造,首先,要構(gòu)建以類球紅細(xì)菌為底盤細(xì)胞的遺傳操作體系。本實(shí)驗(yàn)通過將寬宿主質(zhì)粒pBBR1MCS-2和重組質(zhì)粒pBBR1MCS2-RFP接合進(jìn)入類球紅細(xì)菌,對供體菌大腸桿菌S17.1和受體菌類球紅細(xì)菌的菌濃進(jìn)行配比實(shí)驗(yàn),確立了類球紅細(xì)菌的接合轉(zhuǎn)移操作過程中供體菌和受體菌以0.20D：1.20D的菌濃配比,接合效果好。通過比較供體大腸桿菌S17.1和類球紅細(xì)菌對K2TeO3和萘啶酮酸的耐受性差異,確定了接合子的篩選方法。綜上,獲得了高效準(zhǔn)確的寬宿主質(zhì)粒pBBR1MCS-2接合轉(zhuǎn)移類球紅細(xì)菌方法。2、對質(zhì)粒pBBR1MCS-2進(jìn)行改造,分別串聯(lián)6個外源啟動子和EGFP(綠色熒光蛋白),構(gòu)建了重組載體pBBR1MCS2-tacGFP、pBBR1MCS2-119GFP、 pBBR1MCS2-badGFP、pBBR1MCS2-cpa3GFP、pBBR1MCS2-cpa1GFP pBBR1MCS2-wpa1GFP。將重組載體分別接合轉(zhuǎn)移進(jìn)入類球紅細(xì)菌,通過熒光分光光度計和流式細(xì)胞儀檢測GFP的熒光強(qiáng)度,間接比較了各啟動子的強(qiáng)度依次是tac119badcpa3cpa1wpa1。3、將輔酶Q10合成途徑中重要的限速酶基因ddsa替換EGFP基因串聯(lián)在相對強(qiáng)的啟動子后,構(gòu)建了載體pBBR1MCS2-tac-ddsa、pBBR1MCS2-cpa3-ddsa、 pBBR1MCS2-119-ddsa。還在質(zhì)粒pBBR1MCS2中啟動Kan表達(dá)的啟動子后加上ddsa基因,構(gòu)建了載體Gbbr1-ddsa。將四個重組質(zhì)粒結(jié)合轉(zhuǎn)移進(jìn)入類球紅細(xì)菌,通過HPLC檢測,其中轉(zhuǎn)入質(zhì)粒Gbbr1-ddsa的類球紅細(xì)菌Q10的表達(dá)量達(dá)到220.6 mg/L,較出發(fā)菌株產(chǎn)量提高了15.7%。4、以杜邦專利為參考,對寬宿主質(zhì)粒pBBR1MCS-2的rep基因進(jìn)行隨機(jī)突變,通過重復(fù)篩選驗(yàn)證,獲得溫度敏感質(zhì)粒MpBBR1MCS-2#31。5、定向進(jìn)化能使基因快速突變,人為加入適當(dāng)?shù)暮Y選劑,可以定向選擇出人們所期望得到的具有特定性質(zhì)的菌株。本研究首先對類球紅細(xì)菌進(jìn)行UV(紫外線)和ARTP(常溫低壓等離子技術(shù))處理后,加入輔酶Q10結(jié)構(gòu)類似物三氟丙酮酸及呼吸抑制劑膦胺霉素、魚藤酮共篩選獲得較出發(fā)菌株產(chǎn)量提高了10.3%、12.5%的突變菌株。
【關(guān)鍵詞】：類球細(xì)菌 輔酶Q10 接合轉(zhuǎn)移 pBBR1MCS-2 啟動子 溫敏質(zhì)粒 定向進(jìn)化 ddsa GFP
【學(xué)位授予單位】：福建師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q78
【目錄】：

• 摘要2-4
• Abstract4-6
• 中文文摘6-11
• 緒論11-21
• 第一節(jié) 輔酶Q10簡介11-13
• 第二節(jié) 輔酶Q10的生產(chǎn)方法及研究狀況13-14
• 第三節(jié) 輔酶Q10的高產(chǎn)菌株育種14-16
• 第四節(jié) 類球紅細(xì)菌16-18
• 第五節(jié) 論文的選題依據(jù)和意義18-19
• 第六節(jié) 本研究的主要內(nèi)容19-21
• 第一章 類球紅細(xì)菌接合轉(zhuǎn)移方法的研究21-35
• 第一節(jié) 材料與方法21-30
• 第二節(jié) 結(jié)果與分析30-33
• 第三節(jié) 小結(jié)與討論33-35
• 第二章 強(qiáng)啟動子的篩選35-45
• 第一節(jié) 材料與方法35-38
• 第二節(jié) 結(jié)果與分析38-42
• 第三節(jié) 小結(jié)與討論42-45
• 第三章 不同啟動子過表達(dá)ddsa45-55
• 第一節(jié) 材料與方法45-49
• 第二節(jié) 結(jié)果與分析49-54
• 第三節(jié) 小結(jié)與討論54-55
• 第四章 溫度敏感性質(zhì)粒篩選55-65
• 第一節(jié) 材料與方法55-59
• 第二節(jié) 結(jié)果與分析59-62
• 第三節(jié) 小結(jié)與討論62-65
• 第五章 定向進(jìn)化代謝工程改造RS65-73
• 第一節(jié) 材料與方法65-69
• 第二節(jié) 結(jié)果與分析69-71
• 第三節(jié) 小結(jié)與討論71-73
• 第六章 結(jié)論與展望73-75
• 參考文獻(xiàn)75-83
• 攻讀學(xué)位期間承擔(dān)的科研任務(wù)與主要成果83-85
• 致謝85-87
• 個人簡歷87-90

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本文編號：589040