本文關(guān)鍵詞：串聯(lián)啟動(dòng)子對(duì)細(xì)菌微氧合成聚羥基丁酸酯的影響

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【摘要】：聚羥基脂肪酸酯(PHA)是一類由微生物合成的高分子聚酯,具有廣闊的應(yīng)用前景,然而其居高不下的生產(chǎn)成本極大的限制了其工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用。在發(fā)酵后期由于菌體大量生長(zhǎng)使得發(fā)酵液中的溶氧迅速降低,從而使菌體不可避免的處于微氧發(fā)酵的狀態(tài)。因此可以采用兩步發(fā)酵法來(lái)生產(chǎn)PHA:有氧條件下菌體快速生長(zhǎng),而在微氧條件下菌體大量積累PHA。本文以重組大腸桿菌和鹽單胞菌為研究對(duì)象,嘗試提高菌株微氧合成PHB的能力,從而降低PHA的生產(chǎn)成本。為了提高菌株在微氧條件下PHB合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平,微氧啟動(dòng)子被應(yīng)用到PHB的生產(chǎn)中。確定了11個(gè)潛在的大腸桿菌微氧啟動(dòng)子,通過(guò)兩輪篩選得到了在微氧條件下具有較高活性的透明顫菌血紅蛋白啟動(dòng)子(Pvgb)。將Pvgb應(yīng)用于大腸桿菌的微氧生產(chǎn)中,使重組菌株中PHB的含量達(dá)到了68.48%,比對(duì)照菌株提高了13%。其次,通過(guò)串聯(lián)vgb啟動(dòng)子(Pnvgb)得到了一個(gè)微氧轉(zhuǎn)錄活性顯著提高的啟動(dòng)子:P8vgb。在微氧條件下,重組菌株E.coliS17-1(pBHR-P8vgb)積累了5.4g/L的細(xì)胞干重和90%的PHB。qPCR分析重組菌株phaC的轉(zhuǎn)錄水平表明:phaC基因的轉(zhuǎn)錄水平與PHB合成量呈正相關(guān),P8vgb具有最強(qiáng)的微氧轉(zhuǎn)錄活性。接下來(lái),對(duì)6株常用大腸桿菌的PHB微氧合成能力進(jìn)行了比較,E.coliS17-1為最適菌株。通過(guò)敲除arcA基因進(jìn)一步提高了其微氧適應(yīng)性,重組菌株E.coliS17-1△arcA(pBHR-P8vgb)的PHB積累量為91%,細(xì)胞干重達(dá)6.3g/L。最后,在嗜鹽菌Halomonas sp.LS21中構(gòu)建P8vgb調(diào)控下的VHb和phaCABLS21共表達(dá)質(zhì)粒能顯著提高重組菌株的PHB微氧合成量和細(xì)胞干重。重組菌株Halomonas sp.LS21(pSEVA341-P8vgb-vgb-P8vgb-phaCABLS21)的PHB積累量為75%,比對(duì)照菌株提高了35%,細(xì)胞干重達(dá)4.5g/L,是對(duì)照組的兩倍。發(fā)酵實(shí)驗(yàn)表明:重組菌株P(guān)HB的積累量為75.32%,比對(duì)照菌株提高了25%;細(xì)胞干重達(dá)30.21g/L,比對(duì)照組提高了10g/L。P8vgb是一個(gè)高效的微氧啟動(dòng)子,共表達(dá)VHb蛋白和phaCABLS21能顯著提高菌株Halomonas sp.LS21的PHB含量和細(xì)胞干重。
【關(guān)鍵詞】：聚羥基丁酸酯 微氧啟動(dòng)子 串聯(lián)vgb啟動(dòng)子 鹽單胞菌
【學(xué)位授予單位】：清華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q78;Q936
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 主要符號(hào)對(duì)照表9-10
• 第1章 引言10-26
• 1.1 聚羥基脂肪酸酯概述10-15
• 1.1.1 PHA簡(jiǎn)介10
• 1.1.2 PHA結(jié)構(gòu)及分類10-12
• 1.1.3 PHA的材料學(xué)性能12-14
• 1.1.4 PHA的應(yīng)用14-15
• 1.2 聚羥基脂肪酸酯的生物合成途徑及主要酶15-19
• 1.2.1 PHA主要生物合成途徑15-16
• 1.2.2 PHA聚合酶（PhaC）16-17
• 1.2.3 PHA代謝相關(guān)基因17-19
• 1.3 PHB的發(fā)酵生產(chǎn)19-21
• 1.3.1 利用野生型菌株生產(chǎn)PHB19-21
• 1.3.2 利用重組E.coli生產(chǎn)PHB21
• 1.4 PHA的低成本生產(chǎn)策略21-22
• 1.5 PHB的微氧合成22-24
• 1.5.1 氧氣對(duì)PHB合成的影響22-23
• 1.5.2 E. coli微氧代謝及調(diào)控系統(tǒng)23-24
• 1.5.3 E. coliPHB的微氧合成24
• 1.6 本論文的主要工作及意義24-26
• 第2章 實(shí)驗(yàn)材料與方法26-39
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料26-30
• 2.1.1 菌種26-27
• 2.1.2 質(zhì)粒27-28
• 2.1.3 常用分子生物學(xué)試劑28-29
• 2.1.4 常用生物化學(xué)試劑29
• 2.1.5 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)29-30
• 2.2 實(shí)驗(yàn)常用儀器及設(shè)備30-31
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法31-39
• 2.3.1 常用培養(yǎng)基及抗生素的配制31
• 2.3.2 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法31-36
• 2.3.3 菌種的保存36
• 2.3.4 搖瓶和發(fā)酵罐培養(yǎng)36-37
• 2.3.5 理化分析方法37-39
• 第3章 利用微氧啟動(dòng)子提高菌株P(guān)HB微氧合成量39-47
• 3.1 本章導(dǎo)讀39-40
• 3.2 微氧啟動(dòng)子的分析與確定40
• 3.2.1 大腸桿菌轉(zhuǎn)錄組分析40
• 3.2.2 確定11個(gè)微氧啟動(dòng)子序列40
• 3.3 質(zhì)粒與重組菌的構(gòu)建40-45
• 3.3.1 擴(kuò)增11個(gè)大腸桿菌微氧啟動(dòng)子40-42
• 3.3.2 構(gòu)建微氧啟動(dòng)子調(diào)控rfp基因表達(dá)的質(zhì)粒42
• 3.3.3 微氧啟動(dòng)子對(duì)RFP熒光強(qiáng)度的影響42-43
• 3.3.4 構(gòu)建微氧啟動(dòng)子調(diào)控phaCAB表達(dá)的質(zhì)粒43-44
• 3.3.5 微氧啟動(dòng)子對(duì)PHB合成的影響44-45
• 3.4 本章小結(jié)45-47
• 第4章 利用串聯(lián)vgb啟動(dòng)子（P_(nvgb)）提高PHB微氧合成量47-54
• 4.1 本章導(dǎo)讀47
• 4.2 串聯(lián)vgb啟動(dòng)子（P_(nvgb)）的構(gòu)建47-49
• 4.3 利用串聯(lián)vgb啟動(dòng)子（P_(nvgb)）提高PHB微氧合成量49-50
• 4.3.1 構(gòu)建串聯(lián)vgb啟動(dòng)子（P_(nvgb)）調(diào)控下的phaCAB表達(dá)質(zhì)粒49
• 4.3.2 串聯(lián)vgb啟動(dòng)子（P_(nvgb)）對(duì)PHB微氧合成量的影響49-50
• 4.4 串聯(lián)vgb啟動(dòng)子（P_(nvgb)）調(diào)控下phaC的轉(zhuǎn)錄水平50-52
• 4.5 本章小結(jié)52-54
• 第5章 E.coli菌株對(duì)PHB微氧合成量的影響54-58
• 5.1 本章導(dǎo)讀54
• 5.2 E.coli菌株的選擇54-55
• 5.2.1 確定6種待篩選E. coli菌株54-55
• 5.2.2 不同菌株對(duì)PHB含量的影響55
• 5.3 敲除arcA基因?qū)?xì)胞干重和PHB含量的影響55-57
• 5.4 本章小結(jié)57-58
• 第6章 利用P_(8vgb)提高Halomonas sp.LS21菌株P(guān)HB微氧合成量58-68
• 6.1 本章導(dǎo)讀58-59
• 6.2 異源表達(dá)VHb蛋白對(duì)菌株P(guān)HB微氧合成量的影響59-61
• 6.2.1 構(gòu)建P_(vgb)、P_(8vgb)調(diào)控下的VHb蛋白表達(dá)質(zhì)粒59-60
• 6.2.2 異源表達(dá)VHb蛋白對(duì)PHB合成量的影響60-61
• 6.3 過(guò)表達(dá)phaCAB_(LS21)基因簇對(duì)菌株P(guān)HB合成量的影響61-63
• 6.3.1 構(gòu)建P_(8vgb)調(diào)控下的phaCAB_(LS21)基因簇過(guò)表達(dá)質(zhì)粒61-62
• 6.3.2 過(guò)表達(dá)phaCAB_(LS21)對(duì)菌株P(guān)HB合成量的影響62-63
• 6.4 共表達(dá)VHb蛋白和phaCAB_(LS21)對(duì)菌株P(guān)HB微氧合成量的影響63-65
• 6.4.1 構(gòu)建P_(8vgb)調(diào)控下的VHb蛋白和phaCAB_(LS21)基因簇共表達(dá)質(zhì)粒63-64
• 6.4.2 共表達(dá)VHb蛋白和phaCAB_(LS21)對(duì)菌株P(guān)HB積累量的影響64-65
• 6.5 共表達(dá)VHb蛋白和phaCAB_(LS21)菌株的發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)65-66
• 6.6 本章小結(jié)66-68
• 第7章討論與展望68-73
• 7.1 論文工作總結(jié)與討論68-69
• 7.2 工作展望69-73
• 7.2.1 利用合成生物學(xué)方法構(gòu)建功能模塊69-70
• 7.2.2 不依賴抗生素的表達(dá)系統(tǒng)70-71
• 7.2.3 開發(fā)生產(chǎn)PHA的平臺(tái)菌株71
• 7.2.4 開發(fā)PHA的高附加值應(yīng)用71-73
• 參考文獻(xiàn)73-81
• 致謝81-83
• 附錄A 11個(gè)微氧啟動(dòng)子序列83-85
• 附錄B 串聯(lián)vgb啟動(dòng)子（P_(nvgb)）序列85-88
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷、在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果88

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 SHEN Rui;CAI LongWei;MENG DeChuan;WU LinPing;GUO Kai;DONG GuoXing;LIU Lei;CHEN JinChun;WU Qiong;CHEN GuoQiang;;Benzene containing polyhydroxyalkanoates homo-and copolymers synthesized by genome edited Pseudomonas entomophila[J];Science China(Life Sciences);2014年01期

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中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

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本文編號(hào)：556717