本文關(guān)鍵詞：擴(kuò)展青霉脂肪酶的定向進(jìn)化及其穩(wěn)定性的提高

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【摘要】：天然擴(kuò)展青霉脂肪酶(Penicillium expansum lipase, PEL)的催化特性有其自身的特色,但其在熱穩(wěn)定性、有機(jī)溶劑耐受性等方面,還不能很好地滿足實(shí)際應(yīng)用的需求。本文利用定點(diǎn)飽和突變技術(shù)對(duì)PEL的特定位點(diǎn)進(jìn)行改造,篩選得到PEL突變體,借助畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá),并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)一步分析與鑒定,旨在提高酶的熱穩(wěn)定性和有機(jī)溶劑耐受性,為其進(jìn)一步應(yīng)用提供更好的酶源。具體研究?jī)?nèi)容和主要結(jié)果如下：1、突變體庫(kù)建立和高活性突變株篩選設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物,對(duì)擴(kuò)展青霉脂肪酶的92位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)飽和突變,PCR擴(kuò)增后在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá),并用三丁酸甘油酯乳化液平板篩選突變株,初步得到1株穩(wěn)定性高高于野生型脂肪酶的突變株：D92E。同時(shí),根據(jù)篩選的結(jié)果和半理性設(shè)計(jì)的方法,設(shè)計(jì)了三個(gè)定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn),得到三個(gè)突變株：T66E、N73Q和D151E。2、突變體的表達(dá)及其酶學(xué)性質(zhì)分析將篩選得到的脂肪酶突變體連接到表達(dá)載體pPIC3.5k上,得到四個(gè)重組質(zhì)粒pPIC3.5k-PEL-D92E、pPIC3.5k-PEL-T66E、pPIC3.5k-PEL-N73Q和pPIC3.5k-PEL-D151E。用Sal線性化這四個(gè)重組質(zhì)粒,并電轉(zhuǎn)至畢赤酵母GS5,甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。然后對(duì)其熱穩(wěn)定性及有機(jī)溶劑穩(wěn)定性進(jìn)行了分析與鑒定。主要結(jié)果如下：(1)與野生型脂肪酶相比,突變體D92E熱穩(wěn)定性得到較明顯的提高,在50℃處理10min后,野生型脂肪酶的殘余酶活只有31.72%,而突變體D92E脂肪酶的殘余酶活為70.28%；突變體D151E比野生型脂肪酶的熱穩(wěn)定性稍有提高,提高不明顯；突變體T66E和N73Q比野生型脂肪酶的熱穩(wěn)定性均下降明顯。(2)突變體D92E和D151E比野生型脂肪酶的乙醇耐受性均有所提高,加入乙醇37℃孵育10 min后,突變體D92E脂肪酶的殘余酶活為88.32%,突變體D151E脂肪酶的殘余酶活為95.47%,野生型脂肪酶的殘余酶活為62.06%；突變體T66E和N73Q比野生型脂肪酶的乙醇耐受性均下降明顯。
【關(guān)鍵詞】：擴(kuò)展青霉脂肪酶 定點(diǎn)突變 熱穩(wěn)定性 有機(jī)溶劑耐受性
【學(xué)位授予單位】：福建師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q814
【目錄】：

• 中文摘要2-3
• Abstract3-5
• 中文文摘5-9
• 緒論9-27
• 1.1 脂肪酶的研究進(jìn)展9-15
• 1.2 脂肪酶的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)研究進(jìn)展15-16
• 1.3 酶制劑體外定向進(jìn)化的研究進(jìn)展16-21
• 1.4 脂肪酶穩(wěn)定性相關(guān)研究進(jìn)展21-25
• 1.5 本論文的研究思路及意義25-27
• 第一章 擴(kuò)展青霉脂肪酶D92位點(diǎn)突變體庫(kù)的構(gòu)建及篩選27-37
• 1.1 前言27
• 1.2 材料27-29
• 1.3 方法29-32
• 1.4 結(jié)果與分析32-34
• 1.5 討論34-37
• 第二章 突變體T66E、N73Q、D151E的構(gòu)建及表達(dá)37-53
• 2.1 前言37-38
• 2.2 材料38-40
• 2.3 方法40-46
• 2.4 結(jié)果46-50
• 2.5 討論50-53
• 第三章 突變體的酶學(xué)性質(zhì)研究53-67
• 3.1 前言53-54
• 3.2 材料54
• 3.3 方法54-55
• 3.4 結(jié)果與分析55-59
• 3.5 討論59-67
• 第四章 總結(jié)與展望67-69
• 4.1 創(chuàng)新點(diǎn)67
• 4.2 總結(jié)67-68
• 4.3 展望68-69
• 參考文獻(xiàn)69-79
• 攻讀學(xué)位期間承擔(dān)的科研任務(wù)與主要成果79-81
• 致謝81-83
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷83-87

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8 沈，

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