本文關(guān)鍵詞：果蠅剛毛調(diào)控基因extramacrochaetae上游順式調(diào)控元件的鑒定

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【摘要】：協(xié)同進(jìn)化表現(xiàn)在生物學(xué)不同層面上,在微觀上基因表達(dá)的協(xié)同進(jìn)化中,順-反式調(diào)控的協(xié)同進(jìn)化已有大量研究,但對(duì)同一轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合不同順式調(diào)控元件,多基因調(diào)控的協(xié)同進(jìn)化研究甚少。為了研究多基因調(diào)控的協(xié)同進(jìn)化,本研究以果蠅背板剛毛作為表型標(biāo)記進(jìn)行研究。果蠅粗剛毛(macrochaetae)的發(fā)育受原神經(jīng)基因achaete-scute(ac-sc)的主導(dǎo),ac-sc基因受到上游基因激活而表達(dá)在剛毛生長(zhǎng)的部位。在ac-sc的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中,果蠅extramacrochaetae(emc)基因能夠抑制sc基因履行正常的功能,進(jìn)而抑制粗剛毛的形成,因此emc表達(dá)在沒(méi)有剛毛生長(zhǎng)的部位。果蠅sc基因的轉(zhuǎn)錄能被剛毛調(diào)控基因Pannier(pnr)和Iroquois complex(iro-C)激活,但emc基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制尚不清楚,有研究發(fā)現(xiàn)在pnr與iro-C突變的果蠅中,emc表達(dá)水平變化,鑒于emc和sc基因表達(dá)模式的互補(bǔ)性,推測(cè)emc也受到pnr與iro-C的調(diào)控,emc和sc應(yīng)答相同的反式調(diào)控模式,在剛毛發(fā)育中這兩個(gè)基因的調(diào)控將協(xié)同進(jìn)化。為了驗(yàn)證果蠅emc基因是否也受到pnr與iro-C的調(diào)控,本研究主要專(zhuān)注于對(duì)emc基因上游順式調(diào)控序列的鑒別和功能研究。鑒于此,本研究設(shè)計(jì)了一系列實(shí)驗(yàn)旨在驗(yàn)證pnr和iro-C基因是否會(huì)調(diào)控emc的表達(dá),本研究的主要結(jié)果如下：(1)首先通過(guò)生物信息學(xué)方法分析了黑腹果蠅emc基因上游序列中的GATA. TAAT和ACAnnTGT序列,預(yù)測(cè)了潛在的Pnr結(jié)合位點(diǎn)(GATA)和Iro-C結(jié)合位點(diǎn)(TAAT和ACAnnTGT)；(2)分離克隆出果蠅emc基因上游含有GATA.TAAT和ACAnnTGT保守位點(diǎn)的非編碼序列,構(gòu)建emc基因調(diào)控序列的熒光素酶報(bào)告基因載體,通過(guò)轉(zhuǎn)染細(xì)胞和檢測(cè)熒光素酶活性,在體外利用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)鑒別出emc基因上游2.3 Kb處的順式調(diào)控元件emcE6;(3)構(gòu)建emcE6-EGFP報(bào)告基因轉(zhuǎn)基因載體,通過(guò)顯微注射構(gòu)建得到順式調(diào)控元件emcE6的轉(zhuǎn)基因果蠅,在果蠅體內(nèi)驗(yàn)證了潛在順式調(diào)控元件emcE6的表達(dá)模式和調(diào)控活性；(4)GATA位點(diǎn)突變體的熒光素酶報(bào)告基因分析發(fā)現(xiàn)emcE6中一個(gè)潛在的Pnr結(jié)合位點(diǎn)具有調(diào)控活性,pnr基因參與emc的轉(zhuǎn)錄調(diào)控；(5)對(duì)TAAT位點(diǎn)突變體的熒光素酶報(bào)告基因分析發(fā)現(xiàn)所鑒定的順式調(diào)控元件emcE6中潛在的Iro-C結(jié)合位點(diǎn)無(wú)調(diào)控活性,本研究表明Iro-C轉(zhuǎn)錄因子不參與emc的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。綜上所述,本研究試驗(yàn)結(jié)果表明在果蠅emc基因上游2.3 Kb處存在一個(gè)具有調(diào)控活性的順式調(diào)控元件emcE6; emcE6中一個(gè)潛在的Pnr結(jié)合位點(diǎn)具有調(diào)控活性,調(diào)控emc的轉(zhuǎn)錄；轉(zhuǎn)錄因子Iro-C不參與emc的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。本研究在分子水平上研究了果蠅剛毛調(diào)控基因emc的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制,揭示了果蠅DC剛毛發(fā)育有關(guān)基因emc與sc的調(diào)控將協(xié)同進(jìn)化。本研究為進(jìn)化發(fā)育生物學(xué)的研究提供了具體的事例,具有一定的理論創(chuàng)新性。
【關(guān)鍵詞】：果蠅 剛毛 extramacrochaetae Pannier 順式調(diào)控序列
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：Q78
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 英文符號(hào)說(shuō)明9-13
• 1 文獻(xiàn)綜述13-28
• 1.1 模式生物果蠅13-14
• 1.2 果蠅順式調(diào)控序列14-21
• 1.2.1 順式調(diào)控序列簡(jiǎn)介15-16
• 1.2.2 順式調(diào)控序列與果蠅剛毛16-18
• 1.2.3 順式調(diào)控序列與果蠅色素沉積18-20
• 1.2.4 順式調(diào)控序列與果蠅胚胎發(fā)育20-21
• 1.3 果蠅背板剛毛研究21-24
• 1.3.1 果蠅背板剛毛發(fā)育21-22
• 1.3.2 果蠅背板剛毛調(diào)控22-23
• 1.3.3 果蠅extramacrochaetae(emc)基因23-24
• 1.4 順式調(diào)控序列研究方法24-27
• 1.4.1 熒光素酶報(bào)告基因分析25
• 1.4.2 增強(qiáng)子/報(bào)告基因(Enhancer/reporter)轉(zhuǎn)基因果蠅25-27
• 1.5 研究的目的意義27-28
• 2 材料與方法28-45
• 2.1 試驗(yàn)材料28-31
• 2.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物28
• 2.1.2 試驗(yàn)菌株、細(xì)胞和載體28
• 2.1.3 主要試驗(yàn)試劑及配制28-30
• 2.1.3.1 果蠅培養(yǎng)試劑28
• 2.1.3.2 核酸提取試劑28-29
• 2.1.3.3 電泳相關(guān)試劑29
• 2.1.3.4 載體構(gòu)建及點(diǎn)突變?cè)噭?/span>29-30
• 2.1.3.5 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑30
• 2.1.3.6 其它試劑30
• 2.1.4 主要儀器30-31
• 2.2 試驗(yàn)方法31-45
• 2.2.1 果蠅emc基因上游序列生物信息分析31-32
• 2.2.1.1 果蠅emc基因上游非編碼序列的獲取31-32
• 2.2.1.2 果蠅emc潛在的Pnr和lro-C結(jié)合元件和結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)32
• 2.2.2 果蠅基因組DNA提取和檢測(cè)32-33
• 2.2.3 熒光素酶報(bào)告基因載體構(gòu)建33-39
• 2.2.3.1 引物設(shè)計(jì)34
• 2.2.3.2 PCR擴(kuò)增34-35
• 2.2.3.3 PCR產(chǎn)物的鑒定和膠回收35
• 2.2.3.4 TA連接反應(yīng)35
• 2.2.3.5 轉(zhuǎn)化35-36
• 2.2.3.6 TA克隆鑒定36-37
• 2.2.3.7 酶切37
• 2.2.3.8 連接37
• 2.2.3.9 轉(zhuǎn)化和pGL3-hsp promoter重組菌落篩選37-38
• 2.2.3.10 pGL3-hsp promoter-emc Enhancer重組載體構(gòu)建38-39
• 2.2.4 定點(diǎn)突變熒光素酶報(bào)告載體構(gòu)建39-41
• 2.2.4.1 反向PCR39-40
• 2.2.4.2 Dpn I消化40
• 2.2.4.3 自身環(huán)化40
• 2.2.4.4 轉(zhuǎn)化40-41
• 2.2.4.5 突變體鑒別41
• 2.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及熒光素酶檢測(cè)41-43
• 2.2.5.1 HEK293T細(xì)胞復(fù)蘇41
• 2.2.5.2 HEK293T細(xì)胞傳代41-42
• 2.2.5.3 HEK293T細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染42-43
• 2.2.5.4 熒光素酶檢測(cè)43
• 2.2.6 轉(zhuǎn)基因果蠅品系構(gòu)建及分析43-45
• 2.2.6.1 增強(qiáng)子-EGFP轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建43-44
• 2.2.6.2 顯微注射及構(gòu)建轉(zhuǎn)基因果蠅44
• 2.2.6.3 轉(zhuǎn)基因果蠅分析44-45
• 3 試驗(yàn)結(jié)果與分析45-54
• 3.1 果蠅emc基因上游潛在的Pnr和Iro-C結(jié)合位點(diǎn)45-49
• 3.2 調(diào)控序列熒光素酶報(bào)告基因載體49-50
• 3.3 熒光素酶報(bào)告基因分析結(jié)果50-53
• 3.4 構(gòu)建轉(zhuǎn)基因果蠅53
• 3.5 轉(zhuǎn)基因果蠅翅原基(wing disc)中EGFP表達(dá)模式分析53-54
• 4 討論54-58
• 4.1 果蠅emc基因上游保守非編碼元件55
• 4.2 調(diào)控emc基因的順式調(diào)控元件emcE655-56
• 4.3 Pnr參與emc基因的調(diào)控56-57
• 4.4 emc與sc基因調(diào)控的協(xié)同進(jìn)化57
• 4.5 Iro-C與emc基因57-58
• 5 結(jié)論58
• 6 創(chuàng)新點(diǎn)與展望58-60
• 6.1 本研究主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)58
• 6.2 展望58-60
• 參考文獻(xiàn)60-68
• 致謝68-69
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄69

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2 陳士友,蔣O，

本文編號(hào)：528656