內(nèi)蒙古白絨山羊羊絨的品質(zhì)、產(chǎn)量與次級(jí)毛囊的生長(zhǎng)周期密切相關(guān),研究證明,FGFs基因家族中成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子5(fibroblast growth factor,FGF5 具有調(diào)控毛囊生長(zhǎng)周期的功能。FGF5基因發(fā)生突變會(huì)使毛囊生長(zhǎng)期延長(zhǎng),從而促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)。本研究通過(guò)構(gòu)建gRNA-CRISPR/Cas9質(zhì)粒載體,電穿孔法轉(zhuǎn)染絨山羊胎兒皮膚成纖維細(xì)胞后采用單細(xì)胞接種法接種單細(xì)胞并擴(kuò)繁,提取基因組DNA,經(jīng)PCR及測(cè)序分析得到了雙等位基因編輯的細(xì)胞株,可作為供體細(xì)胞構(gòu)建FGF5基因編輯的絨山羊重構(gòu)胚,為高產(chǎn)絨性狀的絨山羊生產(chǎn)奠定研究基礎(chǔ)。1.根據(jù)絨山羊FGF5基因的第一外顯子序列設(shè)計(jì)2個(gè)gRNA靶點(diǎn)識(shí)別序列,分別構(gòu)建pCas9-FGF5-1、pCas9-FGF5-2質(zhì)粒載體。測(cè)序分析證明兩個(gè)載體構(gòu)建正確。經(jīng)T7核酸內(nèi)切酶Ⅰ檢測(cè)法及SSA活性檢測(cè)法鑒定,兩個(gè)載體均具有活性,pCS7-FGF5-2活性較高,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.應(yīng)用NEPA21高效基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)轉(zhuǎn)染內(nèi)蒙古白絨山羊胎兒皮膚成纖維細(xì)胞,48 h后接種單細(xì)胞培養(yǎng)并擴(kuò)繁,共成功培養(yǎng)135個(gè)單細(xì)胞株。鑒定分析后得到20個(gè)FGF5基因突變細(xì)胞株。經(jīng)...

【文章頁(yè)數(shù)】：55 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
1 引言
    1.1 毛囊的組成及周期
    1.2 FGF5基因的功能及研究
    1.3 基因編輯技術(shù)的發(fā)展
        1.3.1 鋅指酶技術(shù)
        1.3.2 TALEN技術(shù)
        1.3.3 CRISPR/Cas9技術(shù)
    1.4 基因編輯技術(shù)的應(yīng)用
        1.4.1 CRIPSR/cas9基因編輯技術(shù)的應(yīng)用
    1.5 本研究的目的意義及內(nèi)容
2 CRISPR/Cas9編輯絨山羊FGF5基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及活性檢測(cè)
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備及耗材
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及配制
        2.1.3 載體及菌種
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 CRISPR/gRNA載體構(gòu)建
        2.2.2 SSA活性檢測(cè)Cas/gRNA質(zhì)�；钚�
        2.2.3 T7核酸內(nèi)切酶Ⅰ法檢測(cè)Cas/gRNA質(zhì)粒活性
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 Cas/gRNA載體構(gòu)建
        2.3.2 SSA活性檢測(cè)Cas/gRNA質(zhì)�；钚�
        2.3.3 T7核酸內(nèi)切酶Ⅰ法檢測(cè)Cas/gRNA質(zhì)粒活性
    2.4 討論
3 CRISPR/Cas9技術(shù)編輯絨山羊FGF5基因細(xì)胞株的建立
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及及耗材
        3.1.3 實(shí)驗(yàn)主要試劑的配制
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 質(zhì)粒準(zhǔn)備
        3.2.2 絨山羊胎兒皮膚成纖維細(xì)胞的復(fù)蘇
        3.2.3 絨山羊胎兒皮膚成纖維細(xì)胞的傳代
        3.2.4 絨山羊胎兒皮膚成纖維細(xì)胞的凍存
        3.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        3.2.6 單細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定
        3.2.7 細(xì)胞基因組DNA提取及測(cè)序鑒定
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        3.3.2 單細(xì)胞的篩選及擴(kuò)大培養(yǎng)
        3.3.3 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株的鑒定
    3.4 討論
4 全文結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄
作者簡(jiǎn)介



本文編號(hào)：4036893