木質(zhì)纖維素是自然界最豐富的可再生生物質(zhì)資源,其高效降解轉(zhuǎn)化可以生產(chǎn)生物燃料和其它生物基產(chǎn)品,具有廣闊的應(yīng)用前景。自然界中存在著一些能夠高效降解纖維素的微生物,其中,擬桿菌門(mén)成員往往通過(guò)基因組中的多糖利用座位（Polysaccharide utilization locus,PULs）基因簇編碼的淀粉利用系統(tǒng)（Starch Utilization System,Sus）或類淀粉利用系統(tǒng)（Sus-like）實(shí)現(xiàn)多糖底物的降解、吸收與利用。擬桿菌門(mén)的哈氏噬纖維菌（Cytophaga hutchinsoni）是一種能夠高效降解水不溶性結(jié)晶纖維素的好氧的革蘭氏陰性菌。與已知的其它微生物降解纖維素的策略不同,C.hutchinsoni不分泌胞外游離的纖維素酶也不在細(xì)胞表面形成纖維小體結(jié)構(gòu),其纖維素酶結(jié)構(gòu)中也不含明顯的能夠與纖維素結(jié)合的碳水化合物結(jié)合模塊（Carbohydrate Binding Modle,CBM）,人們推測(cè),C.hutchinsoni可能利用一種新穎的機(jī)制完成對(duì)結(jié)晶纖維素的高效降解,但是這種機(jī)制目前還不是十分清楚。本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn),C.hutchiinsoni中可能存在一個(gè)與PUL...

【文章頁(yè)數(shù)】：110 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
第一章 緒論
    1.1 纖維素的結(jié)構(gòu)
    1.2 纖維素的生物降解
        1.2.1 纖維素降解微生物
        1.2.2 纖維素的生物降解策略
    1.3 多糖利用座位的研究
    1.4 碳水化合物結(jié)合模塊的分類與功能
    1.5 哈氏噬纖維菌的研究
        1.5.1 哈氏噬纖維素菌中多糖利用座位的研究
        1.5.2 哈氏噬纖維菌纖維素吸附的研究
    1.6 論文立題依據(jù)及研究?jī)?nèi)容
第二章 chu₁279缺失突變株構(gòu)建及表型分析
    2.1 材料與試劑
        2.1.1 菌株與質(zhì)粒
        2.1.2 引物
        2.1.3 主要儀器
        2.1.4 主要試劑
        2.1.5 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 生物信息學(xué)分析
        2.2.2 常規(guī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.3 C.hutchinsonii基因組提取
        2.2.4 C.hutchinsonii電轉(zhuǎn)化
        2.2.5 回補(bǔ)載體構(gòu)建
        2.2.6 C.hutchinsonii生長(zhǎng)性質(zhì)測(cè)定
        2.2.7 C.hutchinsonii纖維素酶酶活測(cè)定
        2.2.8 菌體的纖維素吸附測(cè)定
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 chu₁279基因序列分析
        2.3.2 chu₁279缺失突變株的構(gòu)建
        2.3.3 突變株Δ1279在不同碳源培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)測(cè)定
        2.3.4 突變株Δ1279纖維素酶活測(cè)定
        2.3.5 突變株Δ1279對(duì)纖維素吸附能力測(cè)定
    2.4 小結(jié)與討論
第三章 CHU₁279重組蛋白的表達(dá)純化與功能探究
    3.1 材料與試劑
        3.1.1 菌株與質(zhì)粒
        3.1.2 引物
        3.1.3 主要儀器
        3.1.4 主要試劑
        3.1.5 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒與重組工程菌株的構(gòu)建
        3.2.2 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)與純化
        3.2.3 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳
        3.2.4 蛋白濃度測(cè)定
        3.2.5 蛋白緩沖液置換方法
        3.2.6 蛋白吸附多糖能力的測(cè)定
        3.2.7 SEM觀察CHU₁279孵育濾紙表面纖維素形態(tài)變化
        3.2.8 DSC測(cè)定熱穩(wěn)定性變化
        3.2.9 蛋白結(jié)晶條件篩選與優(yōu)化
        3.2.10 XRD檢測(cè)CHU₁279孵育纖維素結(jié)晶度變化
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 重組蛋白的異源表達(dá)與純化
        3.3.2 蛋白吸附性質(zhì)測(cè)定
        3.3.3 差示掃描量熱法測(cè)定熱穩(wěn)定性變化
        3.3.4 SEM觀察CHU₁279對(duì)濾紙表面纖維素結(jié)構(gòu)的破壞作用
        3.3.5 CHU₁279蛋白結(jié)晶條件篩選與優(yōu)化
        3.3.6 CHU₁279同源蛋白功能研究
    3.4 討論與小結(jié)
第四章 CHU₁279參與吸附纖維素的重要氨基酸位點(diǎn)的鑒定
    4.1 材料與試劑
        4.1.1 菌株與質(zhì)粒
        4.1.2 引物
        4.1.3 主要儀器
        4.1.4 主要試劑
        4.1.5 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 CHU₁279突變體構(gòu)建方法
        4.2.2 突變體蛋白對(duì)纖維素吸附定性定量實(shí)驗(yàn)
        4.2.3 圓二色譜測(cè)定蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 CHU₁279突變體構(gòu)建及表達(dá)
        4.3.2 突變體蛋白與纖維素的結(jié)合作用分析
        4.3.3 圓二色譜測(cè)定氨基酸點(diǎn)突變對(duì)CHU₁279二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響
    4.4 討論與小結(jié)
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
致謝
學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表



本文編號(hào)：4027722