Syk(spleen tyrosine kinase)是非受體型酪氨酸激酶家族成員之一。在脊椎動物中,Syk是B細胞受體信號通路的主成部分,也能調節(jié)B淋巴細胞的許多生理功能。通過七鰓鰻血液數(shù)據(jù)庫中搜索Syk基因的EST序列,找到一條有效序列,將得到的序列與海七鰓鰻數(shù)據(jù)庫比對,確定了Syk基因的序列。通過3’RACE擴增實驗以及開放閱讀框高保真酶擴增,成功得到了七鰓鰻Syk基因全長序列。通過不同物種的Syk氨基酸序列比對,構建系統(tǒng)發(fā)育樹,分析Syk不同物種的親源關系。此外,還對Syk基因進行結構預測,通過MEME在線軟件對保守基序預測以及抗原表位預測。利用Real-time PCR檢測法,分析對照組和混合菌刺激組的相對表達量,結果顯示在未用混合菌刺激時,Syk在七鰓鰻組織中廣泛表達,當混合菌刺激后,Syk的表達量都有所上調,其中在鰓、白細胞、腎和心的表達量明顯上調,在髓樣小體中的表達量也有上調趨勢。進一步通過Western Blot檢測,以β-actin為內參,在未刺激時,Syk在鰓、髓樣小體和白細胞中表達,經(jīng)過混合菌刺激后,Syk在髓樣小體和白細胞中表達量明顯上調,以上均有統(tǒng)計學意義。...

【文章頁數(shù)】：96 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 緒論
    1.1 Syk分子的結構特點
        1.1.1 TyrKc結構域和SH2結構域
        1.1.2 功能域A和功能域B
        1.1.3 激酶結構域的自動抑制作用
    1.2 Syk的激活調節(jié)模式
        1.2.1 Syk與磷酸化的ITAM的相互作用
        1.2.2 Syk的翻譯后修飾
        1.2.3 Syk的酪氨酸殘基磷酸化作用
    1.3 在病原體識別中Syk的作用
        1.3.1 真菌的識別
        1.3.2 炎癥激活的作用
    1.4 Syk其他的免疫功能
    1.5 Syk的非免疫功能
    1.6 結語
第2章 七鰓鰻Syk的分子克隆及生物信息學分析
    2.1 七鰓鰻Syk的分子克隆
        2.1.1 材料
        2.1.2 方法
        2.1.3 結果
    2.2 Syk編碼氨基酸序列的生物信息學分析
        2.2.1 分析所用的在線網(wǎng)站和軟件
        2.2.2 結果
    2.3 討論
    2.4 小結
第3章 七鰓鰻Syk基因表達與純化
    3.1 實時熒光定量PCR法檢測七鰓鰻Syk在各組織中相對表達量
        3.1.1 材料
        3.1.2 方法
        3.1.3 結果
    3.2 重組Syk載體的構建和原核表達
        3.2.1 材料
        3.2.2 方法
        3.2.3 結果
    3.3 討論
    3.4 小結
第4章 七鰓鰻Syk重組蛋白抗體制備及其鑒定
    4.1 多克隆抗體制備：
    4.2 Western Blot鑒定多克隆抗體的特異性
        4.2.1 材料
        4.2.2 方法
    4.3 結果
        4.3.1 制備多克隆抗體
        4.3.2 Syk多克隆抗體的特異性檢測
    4.4 討論
    4.5 小結
第5章 七鰓鰻Syk蛋白的鑒定
    5.1 材料
    5.2 方法
        5.2.1 混合菌刺激七鰓鰻
        5.2.2 白細胞的分離及組織提取
        5.2.3 白細胞及組織總蛋白的提取
        5.2.4 Western blot分析Syk蛋白的表達情況
        5.2.5 免疫沉淀分析可能與Syk相互作用的蛋白
        5.2.6 免疫熒光分析Syk在白細胞中的定位
    5.3 結果
        5.3.1 白細胞以及組織總蛋白的濃度
        5.3.2 Syk在七鰓鰻不同組織蛋白中的相對表達量
        5.3.3 Syk蛋白的免疫沉淀及其質譜鑒定
        5.3.4 免疫熒光分析Syk蛋白在白細胞中的定位
    5.4 討論
    5.5 小結
結論
本論文創(chuàng)新點
參考文獻
附錄A 七鰓鰻Syk mRNA全序列
附錄B 不同物種的Syk的FASTA格式氨基酸序列
附錄C pET-32a質粒圖譜
附錄D 蛋白質濃度測定標準曲線
附錄E 免疫沉淀質譜圖
攻讀碩士學位期間發(fā)表學術論文情況
致謝



本文編號：3906126