真核生物的組蛋白與DNA構(gòu)成核小體,繼而壓縮形成染色質(zhì)。但這種復(fù)雜構(gòu)象確實(shí)會(huì)影響了DNA的復(fù)制,轉(zhuǎn)錄和修復(fù)等活動(dòng)。促進(jìn)染色質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子(Facilitate Chromatin Transcription,FACT)復(fù)合物是H2A-H2B的結(jié)合伴侶,由SPT16和POB3/SSRP1這2個(gè)亞基構(gòu)成,能夠影響基因的復(fù)制,轉(zhuǎn)錄和修復(fù)等活動(dòng)。嗜熱四膜蟲(chóng)具有特殊的核發(fā)育階段,為了解組蛋白伴侶在染色質(zhì)裝配中如何發(fā)揮作用提供了可能。本文對(duì)FACT的亞基Pob3在四膜蟲(chóng)中的功能展開(kāi)了詳盡的研究。結(jié)果如下:1.嗜熱四膜蟲(chóng)中POB3基因生物信息學(xué)分析促進(jìn)染色質(zhì)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物FACT由SPT16和POB3/SSRP1這2個(gè)亞基構(gòu)成,且POB3和SPT16這2個(gè)亞基存在協(xié)同進(jìn)化。實(shí)時(shí)熒光定量PCR發(fā)現(xiàn),POB3在整個(gè)結(jié)合生殖的表達(dá)量較高,并在6 h達(dá)到頂峰,不過(guò),在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)以及饑餓時(shí)期表達(dá)水平很低。2.HA-Pob3定位在小核和大核為了研究Pob3在四膜蟲(chóng)細(xì)胞中的定位,構(gòu)建了包含HA-Tag的質(zhì)粒pXS75-POB3。免疫熒光定位表明,HA-Pob3在生長(zhǎng),饑餓和接合生殖時(shí)期都定位在小核和大核,其中凋亡的親本大核...

【文章頁(yè)數(shù)】：72 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 組蛋白分子伴侶的概述
    1.2 組蛋白伴侶FACT的功能
    1.3 組蛋白伴侶FACT的組成及結(jié)構(gòu)
    1.4 嗜熱四膜蟲(chóng)概述
    1.5 本課題的研究意義
第二章 嗜熱四膜蟲(chóng)中POB3 基因的生物信息學(xué)分析
    2.1 材料
        2.1.1 細(xì)胞株
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 試劑的配制
        2.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.1.5 引物
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 生物信息學(xué)分析
        2.2.2 嗜熱四膜蟲(chóng)細(xì)胞的培養(yǎng)、饑餓和交配
        2.2.3 嗜熱四膜蟲(chóng)RNA的提取
        2.2.4 cDNA的合成
        2.2.5 POB3 基因的表達(dá)譜分析
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 Pob3和Spt16 的聚類分析
        2.3.2 POB3 表達(dá)譜分析
        2.3.3 Pob3 蛋白序列分析
    2.4 討論
第三章 嗜熱四膜蟲(chóng)中POB3 亞細(xì)胞定位及入核機(jī)制
    3.1 材料
        3.1.1 質(zhì)粒和細(xì)胞株
        3.1.2 試劑
        3.1.3 試劑的配制
        3.1.4 引物
        3.1.5 實(shí)驗(yàn)儀器
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 嗜熱四膜蟲(chóng)的培養(yǎng)、饑餓及配對(duì)
        3.2.2 重組質(zhì)粒pXS-POB3 的構(gòu)建
        3.2.3 重組質(zhì)粒pXS-POB3F3A,pXS-POB3△33,pXS-POB3△87 的構(gòu)建
        3.2.4 嗜熱四膜蟲(chóng)基因槍轉(zhuǎn)化
        3.2.5 突變株的篩選
        3.2.6 嗜熱四膜蟲(chóng)基因組的提取
        3.2.7 Western blot
        3.2.8 間接免疫熒光定位
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 HA-Pob3 定位在大核和小核
        3.3.2 Pob3的C端芳香族氨基酸不影響蛋白定位模式
        3.3.3 Pob3的N端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域一同參與蛋白定位
    3.4 討論
第四章 POB3 敲減抑制了嗜熱四膜蟲(chóng)配子核和合子核的有絲分裂
    4.1 材料
        4.1.1 細(xì)胞株和質(zhì)粒
        4.1.2 試劑
        4.1.3 引物
        4.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 嗜熱四膜蟲(chóng)的培養(yǎng)、饑餓和配對(duì)
        4.2.2 重組質(zhì)粒pNeo-POB3 的構(gòu)建
        4.2.3 重組質(zhì)粒p POB3hpNEO的構(gòu)建
        4.2.4 嗜熱四膜蟲(chóng)基因槍轉(zhuǎn)化
        4.2.5 突變株的篩選
        4.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
        4.2.7 有性生殖時(shí)期細(xì)胞核的觀察
        4.2.8 活細(xì)胞染色觀察
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 KO-POB3 突變株的鑒定
        4.3.2 i-POB3 突變株的鑒定
        4.3.3 POB3 敲減影響了細(xì)胞增殖速率
        4.3.4 POB3 敲減抑制了嗜熱四膜蟲(chóng)合子核和配子核的有絲分裂
        4.3.5 POB3 敲減不影響親本大核的程序化降解
    4.4 討論
參考文獻(xiàn)
總結(jié)與展望
附錄
攻讀學(xué)位期間取得的研究成果
致謝
個(gè)人簡(jiǎn)況及聯(lián)系方式



本文編號(hào)：3863076