家蠅(Musca domestica)是一種世界性分布的昆蟲,具有很好的環(huán)境適應能力和強大的先天免疫系統(tǒng),可以攜帶許多病原微生物而自身不會被感染。家蠅的體內(nèi)能產(chǎn)生多種具有殺菌和抗病毒能力的抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs),它們是家蠅重要的免疫效應因子。抗菌肽是宿主為抵抗病原入侵而產(chǎn)生的一類小分子多肽,是先天免疫的重要組成成分,具有廣譜抑菌活性和不易產(chǎn)生耐藥性的特點。目前我們對家蠅等雙翅目昆蟲的抗菌肽研究較為深入,例如攻擊素(attacin)、天蠶素(cecropin)、雙翅肽(diptericin)、防御素(defensin)和溶菌酶(lysozyme)等。新型抗菌劑的研發(fā)和分離純化制備是目前的研究熱點,例如本實驗的家蠅抗菌肽muscin和domesticin,以及文獻報道的AMP-17、MLH、MAF-1等。作為免疫效應因子,抗菌肽基因的表達在宿主受到病原刺激后往往呈大幅上調(diào)。我們發(fā)現(xiàn)家蠅轉(zhuǎn)錄組中多條未知基因序列在細菌感染后顯著上調(diào),結合生物信息學分析,初步推測其為新型抗菌肽。本研究對其中2條基因序列AMP-5和AMP-8所編碼的蛋白進行了重組表達,并...

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 前言
    1.1 家蠅的抗病能力及其啟示
    1.2 抗菌肽
    1.3 抗菌肽的來源
    1.4 抗菌肽的抑菌機制
        1.4.1 作用于細胞壁靶點
        1.4.2 作用于細胞膜靶點
        1.4.3 作用于細胞內(nèi)靶點
    1.5 抗菌肽的應用
        1.5.1 抗菌肽在臨床上的應用
        1.5.2 抗菌肽在轉(zhuǎn)基因動物的應用
        1.5.3 抗菌肽作為飼料添加劑的應用
    1.6 畢赤酵母真核表達系統(tǒng)
        1.6.1 宿主菌
        1.6.2 表達載體
        1.6.3 畢赤酵母表達系統(tǒng)的特點
    1.7 本課題的研究目的和意義
第二章 實驗材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 供試材料
        2.1.2 主要實驗儀器和試劑
        2.1.3 主要培養(yǎng)基和Tricine-SDS-PAGE的配制方法
    2.2 實驗方法
        2.2.1 家蠅AMP-5和AMP-8 基因的生物信息學分析
        2.2.2 家蠅總RNA提取及c DNA制備
        2.2.3 抗菌肽AMP-5 基因和AMP-8 基因的擴增
        2.2.4 克隆載體pMD-19T-AMP-5和pMD-19T-AMP-8 的構建及雙酶切驗證
        2.2.5 表達載體pPIC9K-AMP-5和pPIC9K-AMP-8 的構建及雙酶切驗證
        2.2.6 pPIC9K-AMP-5和pPIC9K-AMP-8 質(zhì)粒的線性化及酵母感受態(tài)的制備
        2.2.7 酵母的電擊轉(zhuǎn)化及高拷貝轉(zhuǎn)化子的篩選
        2.2.8 蛋白的表達、純化及活性檢測
        2.2.9 抗菌肽AMP-5和AMP-8 抑菌譜的測定
        2.2.10 抗菌肽AMP-5 和AMP-8 作用于細菌后細菌形態(tài)的掃描電鏡觀察
        2.2.11 抗菌肽AMP-5和AMP-8 的體內(nèi)清除實驗
        2.2.12 抗菌肽AMP-5和AMP-8 的溶血活性實驗
第三章 實驗結果
    3.1 家蠅抗菌肽AMP-5 的表達及抑菌活性研究
        3.1.1 AMP-5 基因序列的生物信息學分析
        3.1.2 抗菌肽AMP-5 基因的擴增
        3.1.3 抗菌肽克隆載體pMD-19T-AMP-5 的構建及雙酶切驗證
        3.1.4 抗菌肽表達載體pPIC9K-AMP-5 的構建及雙酶切、線性化驗證
        3.1.5 遺傳霉素篩選pPIC9K-AMP-5 酵母的高拷貝轉(zhuǎn)化子
        3.1.6 抗菌肽AMP-5 的誘導表達及蛋白檢測
        3.1.7 抗菌肽AMP-5 的抑菌圈實驗
        3.1.8 抗菌肽AMP-5 的純化
        3.1.9 抗菌肽AMP-5 抑菌譜的測定
        3.1.10 抗菌肽AMP-5 的體內(nèi)抑菌實驗
        3.1.11 抗菌肽AMP-5 作用于細菌后細菌形態(tài)的掃描電鏡觀察
        3.1.12 家蠅抗菌肽AMP-5 的溶血活性實驗
    3.2 家蠅抗菌肽AMP-8 的表達及抑菌活性研究
        3.2.1 AMP-8 基因序列的生物信息學分析
        3.2.2 抗菌肽AMP-8 基因的擴增
        3.2.3 抗菌肽克隆載體pMD-19T-AMP-8 的構建及雙酶切驗證
        3.2.4 抗菌肽表達載體pPIC9K-AMP-8 的構建及雙酶切、線性化驗證
        3.2.5 遺傳霉素篩選pPIC9K-AMP-8 酵母的高拷貝轉(zhuǎn)化子
        3.2.6 抗菌肽AMP-8 的誘導表達及蛋白檢測
        3.2.7 抗菌肽AMP-8 的抑菌圈實驗
        3.2.8 抗菌肽AMP-8 的純化
        3.2.9 抗菌肽AMP-8 抑菌譜的測定
        3.2.10 抗菌肽AMP-8 的體內(nèi)抑菌實驗
        3.2.11 抗菌肽AMP-8 作用于細菌后細菌形態(tài)的掃描電鏡觀察
        3.2.12 抗菌肽AMP-8 的溶血活性實驗
第四章 討論
    4.1 抗菌肽AMP-5和AMP-8 的篩選
    4.2 抗菌肽AMP-5和AMP-8 的獲取
    4.3 抗菌肽AMP-5和AMP-8 的抑菌活性
    4.4 抗菌肽AMP-5和AMP-8 的抑菌機制
    4.5 抗菌肽AMP-5和AMP-8 的溶血活性
    4.6 抗菌肽AMP-5和AMP-8 的研究展望
第五章 結論
參考文獻
致謝
攻讀學位期間取得的科研成果



本文編號：3836336