H5N1高致病性禽流感(HPAI)是長(zhǎng)期以來(lái)威脅人和動(dòng)物健康的人畜共患病,在季節(jié)性暴發(fā)中常常體現(xiàn)出跨物種傳播的特性。H5N1高致病性禽流感病毒(HPAIV)在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的復(fù)制依賴(lài)于病毒核糖核蛋白復(fù)合體(vRNP)所參與的一系列復(fù)雜生物學(xué)進(jìn)程,而病毒非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1)則在病毒vRNP發(fā)揮功能的過(guò)程中與宿主細(xì)胞進(jìn)行著廣泛復(fù)雜的相互作用,為了使病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制得以順利進(jìn)行,NS1蛋白將會(huì)抑制宿主的固有免疫系統(tǒng),同時(shí)強(qiáng)化病毒的聚合酶活性。包含AT鉤結(jié)構(gòu)域鋅指蛋白(ZFAT)是鋅指蛋白家族成員之一,具有調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞分化及維持外周血免疫細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的功能,作為免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,至今未見(jiàn)其參與抗病毒免疫的報(bào)道。本文為探討ZFAT在流感病毒感染進(jìn)程中的功能與分子機(jī)制,利用規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列(CRISPR)基因編輯技術(shù)構(gòu)建ZFAT敲除細(xì)胞系A(chǔ)549-CRISPR-Cas9-ZFAT,通過(guò)復(fù)制滴定試驗(yàn)檢測(cè)H5N1 HPAIV在該細(xì)胞系中的復(fù)制能力,激光共聚焦檢測(cè)流感病毒感染條件下ZFAT的空間分布變化,揭示ZFAT沉默對(duì)流感病毒感染進(jìn)程的影響,核質(zhì)分離試驗(yàn)分析ZFAT沉默對(duì)流感病毒v...

【文章頁(yè)數(shù)】：42 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Summary
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 H5N1 高致病性禽流感(HPAI)及其復(fù)制機(jī)制
    1.2 流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白1(NS1)與抗病毒固有免疫
    1.3 宿主因子ZFAT與病原-宿主互作
    1.4 CRISPR-Cas9 基因編輯技術(shù)
    1.5 本研究的目的與意義
第二章 ZFAT敲除細(xì)胞系的構(gòu)建與ZFAT沉默對(duì)H5N1 HPAIV復(fù)制的影響
    2.1 材料
        2.1.1 病毒株及雞胚
        2.1.2 細(xì)胞系及載體
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 主要儀器
        2.1.5 Oligo序列設(shè)計(jì)與合成
    2.2 方法
        2.2.1 ZFAT敲除細(xì)胞系構(gòu)建
        2.2.2 流感病毒復(fù)制滴定
        2.2.3 激光共聚焦試驗(yàn)(Confocal Microscopy)
        2.2.4 核質(zhì)分離試驗(yàn)
        2.2.5 蛋白免疫印跡試驗(yàn)(Western Blot)
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 ZFAT敲除效果驗(yàn)證
        2.3.2 敲除ZFAT抑制H5N1 HPAIV的復(fù)制
        2.3.3 ZFAT沉默延緩H5N1 HPAIV的 vRNP入核
        2.3.4 ZFAT沉默降低H5N1 HPAIV vRNP的組裝效率
        2.3.5 ZFAT與 H5N1 HPAIV NP蛋白的空間分布存在重疊
    2.4 討論
第三章 ZFAT過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與病毒-宿主的相互作用
    3.1 材料
        3.1.1 細(xì)胞系及載體
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 主要儀器
        3.1.4 引物設(shè)計(jì)與合成
    3.2 方法
        3.2.1 過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建與免疫共沉淀試驗(yàn)
        3.2.2 蛋白免疫印跡試驗(yàn)
        3.2.3 激光共聚焦試驗(yàn)
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 AH05-NS1 蛋白K41 氨基酸位點(diǎn)調(diào)控與ZFAT的相互作用
        3.3.2 K41位點(diǎn)是AH05-NS1的核定位信號(hào)
    3.4 討論
全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)介
導(dǎo)師簡(jiǎn)介



本文編號(hào)：3835344