本文關鍵詞：Ly6基因家族新成員—斑馬魚Lypc的表達模式及功能研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：Ly6/uPAR/CD59/netuotoxin基因超家族(Ly6SF)存在于很多后生動物中,基因功能較為多樣化。Ly6家族被稱作淋巴抗原6或蛇毒素家族,保守的ly6/uPAR(LU)結構域包含了8到10個半胱氨酸構成的四至五對保守的二硫鍵,形成三指蛋白結構域(three-fingered protein domain, TFPD),家族成員具有序列保守性低,進化速度快,成員數(shù)量龐大并且功能多樣化等特點。果蠅、小鼠、人中的部分Ly6家族成員表達和功能已有定論,但迄今為止,Ly6基因超家族在胚胎發(fā)育中的研究較少。本實驗以模式動物斑馬魚為研究對象,本實驗室前期已經(jīng)通過大量比對斑馬魚基因組的方法,搜尋到了位于不同染色體上的具有LU結構域的多個基因,已確定部分基因在側線神經(jīng)簇、表皮、松果體、離子通道等部位特異表達,表達分布的多樣性提示Ly6基因超家族在斑馬魚中與在人類中一樣,也能執(zhí)行各種各樣的功能。本研究從已鑒定的Ly6家族成員中篩選出其中一個基因進行了初步的探究,基因定位于斑馬魚的15號染色體(XP_003200124)上,因為序列的不保守性,無法確定其直線同源基因,故根據(jù)其表達部位為色素細胞,命名為Lypc。通過同源建模、序列比對、功能域分析等生物信息學工具分析了Lypc的特性。Lypc基因由三個外顯子組成,其cDNA含有一個381bp的開放閱讀框,氨基端有明顯的信號肽,編碼126個氨基酸殘基的GPI錨定蛋白,其中包含一個LU domain/三指蛋白結構域,具有Ly6基因超家族的典型特征。斑馬魚胚胎原位雜交及石蠟切片的結果顯示：這個基因的表達具有組織特異性。胚胎早期幾乎沒有表達,發(fā)育到38小時以后才有明顯的特異性表達,主要表達于表皮色素細胞以及視網(wǎng)膜表皮色素細胞,而不在深層細胞。說明Lypc可能在色素細胞出現(xiàn)后才開始表達。實時定量RT-PCR結果表明Lypc的表達量還在成年斑馬魚不同組織表現(xiàn)出了較大的差異,在皮膚、眼睛、腸道中的表達量較高,而在肌肉、肝臟、鰓中幾乎沒有表達。突變體Casper中Lypc在軀干上的表達缺失,表明Lypc在皮膚上的表達主要集中在色素細胞中。實時定量PCR的結果顯示Lypc的表達量受到光照黑暗交替的晝夜節(jié)律影響,呈現(xiàn)晝夜不同的表達模式,并且黑暗環(huán)境的調控與其表達呈正相關關系。進一步的過表達實驗并未胚胎發(fā)育有明顯異常。為了繼續(xù)探究Lypc的功能,我們構建了rALENs敲除載體,進行基因敲除實驗,目前純合突變體的篩選工作正在進行中。Lypc基因的研究為Ly6基因超家族在胚胎發(fā)育中的表達模式及其功能探索提供了一定的理論依據(jù)。
【關鍵詞】：斑馬魚 Ly6基因超家族 色素細胞 視網(wǎng)膜 晝夜節(jié)律
【學位授予單位】：中國海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q78
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 第一章 前言11-24
• 1 Ly6基因超家族概述11-13
• 1.1 Ly6基因超家族基因的功能11-13
• 2. Ly6家族的特有結構——三指蛋白13-14
• 3. 斑馬魚的色素細胞14-18
• 3.1. 斑馬魚的虹彩細胞15-17
• 3.2 斑馬魚視網(wǎng)膜色素細胞17-18
• 4. 斑馬魚的生物節(jié)律研究18-21
• 4.1 光照對斑馬魚生物周期的影響18-21
• 5. 研究Lypc的目的和意義21-24
• 第二章：實驗材料和方法24-60
• 1 實驗材料24-25
• 1.1 斑馬魚24
• 1.2 實驗試劑24-25
• 1.3 實驗儀器25
• 2 實驗方法25-60
• 2.1 斑馬魚Lypc原位雜交體外探針合成25-33
• 2.2 斑馬魚胚胎整體原位雜交33-37
• 2.3 斑馬魚Lypc石蠟切片37-38
• 2.4 原位雜交后冰凍切片制作38
• 2.5 斑馬魚Lypc mRNA的過表達38-45
• 2.6 斑馬魚胚胎總RNA的提取45-46
• 2.7 反轉錄46
• 2.8 半定量PCR46-47
• 2.9 實時定量PCR(Real time-PCR)47-49
• 2.10 構建類轉錄激活因子效應物(TALEN)質粒載體49-55
• 2.11 TALEN顯微注射及突變體選育55-57
• 2.12 Lypc生物節(jié)律實驗57-58
• 2.13 LPS處理胚胎Real-Time實驗58-59
• 2.14 Lypc基因及其編碼蛋白的生物信息學分析59-60
• 第三章：實驗結果60-78
• 1 斑馬魚Lypc基因序列結構分析60-78
• 1.1 Lypc基因編碼的的一級結構60
• 1.2 信號肽預測60-61
• 1.3 結構域預測61
• 1.4 GPI錨定信號預測61-62
• 1.5 蛋白質序列比對62-63
• 1.6 Lypc蛋白結構的同源建模63
• 1.7 Lypc基因在斑馬魚中的表達模式63-72
• 1.8 Lypc的功能研究72-78
• 第四章 ：討論78-81
• 1 斑馬魚中的Lypc為Ly6家族成員78
• 2 Lypc基因的表達模式78-79
• 3 Lypc基因的功能預測79-81
• 結論81-82
• 參考文獻82-88
• 附錄88-89
• 致謝89-90
• 個人簡歷90-91
• 發(fā)表的學術論文91

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