被子植物通過花粉管的生長將兩個精子細(xì)胞運送到胚囊中,與卵細(xì)胞和中央細(xì)胞融合形成受精卵和胚乳,完成雙受精過程。因此,花粉管的生長對于植物完成雙受精是至關(guān)重要的。胞吐和內(nèi)吞在維持花粉管的生長過程中起到重要作用。果膠甲酯酶(PME)使高甲酯化的果膠質(zhì)去甲酯化,形成的低甲酯化果膠質(zhì)與Ca²⁺交聯(lián),從而維持花粉管硬度,在花粉發(fā)育和花粉管生長過程中起到重要的作用。PME能夠通過胞吐的方式到達(dá)花粉管前端的細(xì)胞壁從而發(fā)揮功能,而其是否會參與內(nèi)吞過程卻不清楚。擬南芥TML基因編碼一個內(nèi)吞復(fù)合體亞基,可以與貨物蛋白結(jié)合。前期我們通過酵母雙雜交篩選得到一個與其互作的蛋白pectin methylesterase 21(PME21)。PME21基因從12時期開始在花粉及花粉管中高量表達(dá),這與TML在花粉/花粉管中的表達(dá)模式一致。對PME21的亞細(xì)胞定位進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn),PME21分布在花粉的萌發(fā)孔以及花粉管的頂端。我們在前期的研究過程中鑒定到一個擬南芥T-DNA插入的突變體pme21-1。與TML突變體一致,pme21-1/+大約有一半的花粉形態(tài)異常。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)花粉是從12時期開始出現(xiàn)活...

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【學(xué)位級別】：碩士

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中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 被子植物雄配子體的發(fā)育與結(jié)構(gòu)
        1.1.1 花粉的發(fā)育
        1.1.2 花粉粒的結(jié)構(gòu)
    1.2 花粉與雌蕊組織的相互作用
        1.2.1 花粉的粘附與識別
        1.2.2 花粉的水合與萌發(fā)
        1.2.3 花粉管的生長
            1.2.3.1 花粉管細(xì)胞壁果膠質(zhì)的分布和修飾
            1.2.3.2 花粉管生長中的胞吐作用
            1.2.3.3 花粉管生長參與的內(nèi)吞作用
    1.3 網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用
    1.4 植物果膠甲酯酶PME
        1.4.1 果膠甲酯酶的類型
        1.4.2 果膠甲酯酶的結(jié)構(gòu)
        1.4.3 果膠甲酯酶活性的調(diào)控
        1.4.4 PRO區(qū)域在PME定位和功能中的作用
        1.4.5 PME調(diào)控花粉管的生長
    1.5 果膠甲酯酶抑制因子PMEI
    1.6 本實驗的目的與意義
2 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗材料及培養(yǎng)條件
        2.1.2 菌株和質(zhì)粒
        2.1.3 酶與生化試劑
            2.1.3.1 酶類
            2.1.3.2 基本生化藥劑
            2.1.3.3 各種緩沖液及培養(yǎng)基配方
        2.1.4 實驗中所使用的引物名稱及序列
    2.2 實驗方法
        2.2.1 轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建
            2.2.1.1 PCR引物設(shè)計
            2.2.1.2 PCR擴(kuò)增目的片段
            2.2.1.3 擴(kuò)增產(chǎn)物的膠回收
            2.2.1.4 目的片段與克隆載體連接
            2.2.1.5 制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞
            2.2.1.6 大腸桿菌感受態(tài)轉(zhuǎn)化
            2.2.1.7 大腸桿菌菌落PCR鑒定
            2.2.1.8 陽性菌落的測序
            2.2.1.9 質(zhì)粒的提取
            2.2.1.10 質(zhì)粒DNA的酶切
            2.2.1.11 目的DNA片段與載體DNA片段的連接
        2.2.2 農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化
            2.2.2.1 根癌農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞的制備
            2.2.2.2 凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
        2.2.3 實驗材料擬南芥的種植和轉(zhuǎn)化
            2.2.3.1 擬南芥的種植
            2.2.3.2 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥
        2.2.4 植物總DNA的提取
        2.2.5 植物總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄
        2.2.6 Real-time PCR分析
        2.2.7 GUS染色
        2.2.8 亞歷山大染色
        2.2.9 苯胺藍(lán)染色
        2.2.10 花粉果膠質(zhì)染色
        2.2.11 花粉萌發(fā)實驗
        2.2.12 體內(nèi)誘導(dǎo)花粉管生長實驗
        2.2.13 Aritifical miRNA突變體的構(gòu)建
3 結(jié)果與分析
    3.1 PME21的組織表達(dá)模式及定位
        3.1.1 PME21的表達(dá)模式
        3.1.2 PME21的亞細(xì)胞定位
    3.2 擬南芥pme21-1/+突變體表型觀察
        3.2.1 pme21-1/+突變體花粉形態(tài)異常
        3.2.2 pme21-1/+突變體花粉體外萌發(fā)異常
        3.2.3 pme21-1/+突變體花粉從12a時期出現(xiàn)細(xì)胞壁成分積累異常
    3.3 CRISPR/Cas9 技術(shù)創(chuàng)制擬南芥PME21 突變體
    3.4 PME21參與花粉管生長
        3.4.1 下調(diào)PME21的表達(dá)影響花粉管的生長
        3.4.2 PME21調(diào)控果膠質(zhì)在花粉管上的分布
    3.5 PME21的分段定位
    3.6 PME21可能參與花粉管生長方向的改變
    3.7 PME21與TML互作
        3.7.1 PME21-mCherry和 TML-YFP存在共定位關(guān)系
        3.7.2 下調(diào)TML的表達(dá)會影響PME21 在花粉管中的定位
    3.8 內(nèi)吞抑制劑處理影響PME21的定位
4 討論
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文及成果



本文編號：3787692